妊娠前の炎症が神経発達に与える評価のための早期妊娠母体免疫活性化マウスモデルの生成

私たちの研究室は、出生前炎症が脳の免疫細胞であるミクログリアの生物学にどのように変化させるかを研究しています。ミクログリアは神経発達の悪影響に寄与しています。既存のMIモデルは妊娠中期に焦点を当てています。しかし、生存率と一貫性を向上させるために品質管理指標を組み込んだ早期妊娠プロトコルを提示します。

このモデルは、環境炎症が脳の発達に与える影響を探るために、あらゆる野生型や遺伝子マウスモデルに適用可能です。まず、8週から10週齢のC57 BL6メスのメス2匹を、午後遅くか夕方にC57 BL6のブリーダーオスとセットアップします。翌朝、メスのマウスに膣プラグがあるかどうかを評価し、プラグが起こるまで1日1回検査を続けます。

プラグは一時的なもので、朝に確認しなければ午後までに抜け落ちる可能性があります。膣プラグを確認した後、メスのマウスの体重を測定し、妊娠期間中の体重増加を追跡して妊娠状況を監視します。プラグを通したメスは個別のケージに分け、標準的な飼育環境で自由に餌や水を得られる環境で管理します。

プラグされた女性は胚0.5日目と指定し、膣プラグの日付を記録して妊娠週数の正確な記録を確保します。凍乾したポリICを高濃度のストック溶液に再構成するには、製造元の指示に従って滅菌生塩水または滅菌水に溶解します。ボルテックスは高濃度のストック溶液です。

その後、溶液を生理食塩水で希釈して低濃度のストックを準備します。繰り返しの凍結融解を避けるために、低濃度のストックを約125マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分け、チューブを20度または80度の温度で保存します。胚発生9.5日目の注射直前です。

低濃度のポリICストックを無菌生理食塩水で希釈し、作動濃度を得ます。作業用ストックを65度摂氏で10分間加熱し、二本鎖リボ核酸構造の適切な再調整を確保します。その後、溶液をボルテックスまたはピペットで混ぜて均一な混合物にしてから注入します。

妊娠を確認するには、胚発生9.5日目の朝にダムの重さを測ってください。母体免疫活性化(MIA)ではポリIC注射量、対照群の場合は0.9%の生理食塩水注射量を計算します。準備済みのポリIC作業液または生理食塩水の適切な量を、滅菌27ゲージ以下の注射器に抽出します。

今度は、痛みと苦痛を最小限に抑えるためにダムを適切に拘束してください。ポリIC酸または生理食塩水を、股関節のすぐ上または右の腹底、または乳首の2組目に腹腔内で注射します。その後、注射器はBioSafety Sharpsの容器に捨ててください。

また、注射側の記録を残して、コホート全体の一貫性を保ちましょう。すぐにダムをホームケージに戻し、異常の兆候がないか監視してください。その後、注射後少なくとも24時間はハイドロゲルを補給し、病気行動に伴う脱水を防ぎます。

その後、注射量、注射日時、妊娠週数、ロット番号を記録します。注射後3時間後、1分ずつマウスを観察し、活動減少、前かがみ姿勢、顔のしかめ面、便などの行動を3点スケールで評価します。これらの行動のいずれかを示すマウスは急性疾患行動として分類します。

その後、尾部出血などの低侵襲方法を用いて、注入されたダムから母体血液を慎重に採取します。約50マイクロリットルの血液を採取してください。止血を確認したら、ダムを元のケージに戻します。

集めた血液を室温で30分間凝固させます。サンプルを室温で2000Gで5分間遠心分離し、血清を血栓から分離します。再度遠心分離後、血栓を乱さずに透明な上部血清層を慎重に採取します。

血清は20度の温度で保存し、下流のサイトカイン分析の準備が整うまで保管してください。注射後は、3日間毎日ダムを計量し、ポリIC酸への反応を観察してください。出産予定日には、妊娠に失敗したことを示すために、子犬数、子犬の生存可能性、またはなしなどの子猫の結果を記録してください。

死亡した子犬は機関のバイオセーフティガイドラインに従って迅速に取り除き、処分してください。ELISAまたは多重アッセイを用いて、MIA後の母体血清中のIL-6やTNF-αなどの炎症性サイトカインを定量し、製造元の指示に従ってコントロール注射を行います。定量化後、結果を用いてMIA応答の代表的な閾値を確立します。

最後に、当社のソフトウェアを用いて母体血清IL-6とTNFアルファレベルの関係を統計解析します。胚発生9.5日目にポリIC投与後、MIAダムは対照ダムに比べてIL-6レベルが有意に増加しました。TNFアルファレベルは母体のIL-6値と強い正の相関を示しました。

胚発生日0.5日目から9.5日目の間に、子孫を産むことに成功したダムは、産まれなかった母親よりも有意に多くの体重を増やしました。注射から1日後、MIAダムは体重が減り、生理食塩水処理済みのコントロールダムは体重が増加しました。しかし胚発生12日目には、両グループともほぼ同じ体重増加を示しました。

妊娠前の体重は、生理食塩水処理済みの対照群もMIAダムの砂粒効率に影響を与えませんでした。しかし、ジャクソン研究所から調達されたC57 BL6マウスは、MIA手術中にチャールズリバーから調達されたC57 BL6マウスよりも成功した子孫数が多かった。対照的に、ポリICの発生源は砂の効果に影響を与えませんでした。

さらに、ジャクソン研究所から採取した動物は、チャールズリバーから採取した動物よりも血清IL-6で測定された母体炎症反応がより強力でした。対照的に、異なるポリICの原因間で母体の炎症反応は同じでした。このプロトコルは初期MIAモデルの再現性生成と、母体炎症の重症度と子孫の実験結果の相関関係を可能にしています。詳細な記録の維持、試薬のロット数の追跡、すべてのダムにおける母体サイトカイン応答の評価が、再現性を確保するために非常に重要です。