肝線維症マウスモデルにおける肝星状細胞形態のマッピング

本プロトコルは、肝臓の完全な肝組織における星状細胞の形態を可視化・モデル化するための包括的な画像パイプラインを提供します。現在の2D画像では、星状細胞の完全な形態が見落とされており、構造的および機能的な洞察が制限されています。このプロトコルにより、複雑な3Dアーキテクチャの堅牢なキャプチャが可能になります。

まず、麻酔をかけたマウスの手のひらをつまんで適切な麻酔を確実にします。腹部に70%エタノールをスプレーして毛を湿らせます。鉗子を使って、後ろ脚と合わせた腹部の中央の皮膚を拾い上げ、腹部を露出させるために皮膚を切り始めます。

次にPBSで濡らした綿棒で腸や他の臓器を横に動かし、左葉を持ち上げます。左葉と尾状葉の間に付着している膜を慎重に切断します。次に、左葉の上部の根元で縫合糸で結びます。

縫合結び目の下の左葉を切り取り、組織サンプルの採取と処理のために取っておきます。PBSで濡らした綿棒を使って肝臓を動かし、門脈を露出させます。次に、カテーテル針を門脈の長さのほぼ中間あたりに慎重に挿入します。

カテーテルの針を抜いてください。カテーテルを通る血液の逆流を確認し、挿入が成功したことを示します。稼働中の灌流ポンプから充填されたチューブをカテーテルに接続し、肝臓に20ミリリットルのPBSを灌流します。

肝臓の上にある肺動脈を止血鉗で挟み、PBSが心臓を通過するのを止めます。下大静脈を切って圧力の蓄積を解放します。ポンプの速度を毎分5ミリリットルに調整してください。

15分後にポンプを停止し、リザーバーを4%パラホルムアルデヒドに交換し、肝臓に4%パラホルマルデヒドを25ミリリットル灌流します。灌流が完了したら、連結組織を切断して周囲の臓器から肝臓を取り出します。肝臓を50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、4%パラホルマルデヒド25ミリリットル入りのチューブに入れます。

チューブを、温度4度の冷たい部屋で、毎分1.5回転でベンチロッキングプラットフォームに水平に置きます。翌日、PBSでベンチロッキングプラットフォームの上で、室温で毎分1.5回転、それぞれ30分間レバーを洗います。肝臓を0.02%アジドウムを含むPBS20ミリリットルに移し、4度の温度で保存します。

肝臓サンプルを約0.5〜1立方センチメートルの大きさの小片に切り分けます。肝臓のサンプルをスクリュートップ付きのガラスバイアルに移します。試料を水で希釈したメタノール系列で、20%から80%の水輪回転機で1分間8回転、室温で1時間ずつ脱水します。

サンプルの漂白、透過化、免疫標識、クリアリングを行った後、ジベンジルエーテルで一晩室温で培養し、その後イメージングを行います。試料はジベンジルエーテルで最大1年間保存しても染色信号が失われません。共焦点イメージングでは、クリアしたサンプルを35ミリのガラス底皿に1.5枚のガラス底プレートに入れます。

皿にエチルシナ酸塩を入れてサンプルを完全に浸します。次に、アンテナを共焦点顕微鏡のステージに置きます。1024×1024のフォーマットと速度600で、最も明るい平面でタイル画像を取得し、サンプルの広い範囲を捉えます。

タイル画像を基に、より高解像度のZスキャンを取得するために関心のある領域を選択します。次に、1024×1024フォーマットと600のスキャン速度で、顕微鏡がサポートする最高解像度でクリア組織の全深度をカバーするZスタックを取得します。マウス肝臓の灌流と固定に成功した結果、均一な淡いベージュ黄色の色が得られました。

不適切な灌流により血栓が濃い赤色または茶色の領域となり、光学的鮮明さが低下し、これらの領域で高い背景信号を引き起こしました。ジベンジルエーテルでのインキュベーション後、組織がクリアになる前と比べて完全な光学的透明性が達成されました。高解像度のZスタックは、個々の肝星状細胞の細胞体から伸びる微細な樹状突起を明らかにしました。

対照および慢性四塩化炭素肝サンプルの両方で、共焦点顕微鏡下で強く安定した蛍光信号が認められました。このパイプラインは、複雑なマイクロ環境サーバー内で星状細胞の形態を再現可能にマッピングし、樹状突起や隣接細胞との空間的関係を捉えます。プロトコルを実行する際には、時間的なコミットメントが重要な考慮事項です。

クリアリングのプロセスには約3週間かかり、事前の計画が必要です。精密な3D形態計測解析を可能にするこのプラットフォームは、線維芽細胞構造と機能の結びつきを可能にし、組織の恒常性とZメカニズムの理解を深めます。