酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

私たちの研究は、収量、純度、生存可能性、機能寿命を最適化するための標準化された高スループットルイスラットアイレット分離プロトコルの開発に焦点を当てています。既存の方法は、不純で短命なアイレットが変動します。このプロトコルは消化、精製、プールを標準化し、一貫性と寿命を向上させます。

まず、安楽死させられたラットを顕微鏡で観察します。皮膚ハサミを使い、恥骨合成部から各側肋骨に向かってV字型の切開をして腹腔にアクセスします。平らな鉗子を使い、小腸と大腸を動物の左側に引き戻し、腹腔の作業空間をクリアにします。

次に平らな鉗子と曲がった止血鉗を使って上十二指腸を広げます。総胆管と肝門脈が視界内に入っていることを確認してください。次に、湾曲した止血抑制器を使って肝臓を頭側方向に引っ込めます。

肝臓から1〜2ミリメートル離れたところで、総胆管と肝静脈を挟みます。顕微鏡下で、平らな鉗子と平らな止血器を使って、十二指腸内の内容物を優しく動員して、聴覚括約筋をクリアにします。次に、十二指腸をアウディ括約筋の両側から約5ミリの位置で優しくクランプし、周囲の領域を隔離します。

組織の完全性を保つために、圧迫は最小限に抑えてください。無菌WDMを入った注射器の針を十二指腸壁から慎重に挿入します。針を括約筋体に通し、主膵管に進めて灌流します。

一定圧力を維持しながら、膵臓が完全に膨張するまで、約毎秒500マイクロリットルの速度で7〜10ミリリットルのWDMを灌流します。次に、十二指腸から両方の平らな止血栓を取り外します。その後、脾臓、胃、大腸、十二指腸、間膜から膵臓を周囲の構造から優しく切り離し、解放します。

灌流した膵臓を平らな鉗子で優しく持ち上げ、細かい解離ハサミで残った結合組織の付着部分を切断します。切除した膵臓をすぐに氷で冷たい洗浄液を入れたペトリ皿に移し、切除した膵臓を洗浄しながら次の膵臓を採取します。膵臓を洗浄するには、細かい湾曲した鉗子と細かい解離用のハサミを使い、灌流膵臓からリンパ節、脂肪組織、介膜、大きな血管を慎重に除去します。

洗浄した膵臓を、25ミリリットルの冷温WDMを含む滅菌600ミリリットルのビーカーに移します。手術室から細胞培養室への移送時の清潔さを保つため、ビーカーを滅菌アルミホイルで覆います。ビーカーを1分間130回転の軌道シェーカー水浴に移し、10分間浸します。

5分経過したら、ビーカーを時計回りに手で回し、次に反時計回りに回して組織解離を助けます。10分経過したら、ビーカーを素早く移し氷に浸して酵素の活性を遅らせます。その後、ビーカー内の溶液に等量のクエンチングバッファーを加えて消化を止めます。

50ミリリットルの注射器に14ゲージの脊髄針を装着し、組織懸濁液を優しく吸引して繰り返し排出し、大きな組織片を解離します。サスペンションを200ミリリットルの円錐形チューブに移します。懸濁液を遠心分離した後、上清液を慎重にデカントし、ペレットを100ミリリットルの洗浄液に再懸浮させます。

次に、無菌の500マイクロメートルのふるいで、無菌の600ミリリットルのビーカーの上に置いて、大きな未消化組織を除去します。ろ過液を新しい200ミリリットルの円錐管に移してから、再度遠心分離します。アイレット精製には、事前に結合された10ミリリットルの血清学ピペットを使い、各組織ペレットをペレット体積2ミリリットルあたり15ミリリットルの勾配溶液に再懸浮させます。

サスペンションが均一になるまで優しく混ぜます。各50ミリリットルの円錐形管の底部に15ミリリットルのセル懸濁液を慎重に注ぎ、管壁との接触を避けてきれいな勾配を確保します。その後、シリンジポンプを使って各勾配を10ミリリットルずつ毎分5ミリリットルの速度で投与し、16ゲージの針先をチューブの内壁に当てて混ざり合わないようにします。

チューブを遠心分離した後、勾配層の界面にあるアイレット層を特定します。結合した過去ピペットを使い、アイレット層を採取し、集めたアイレットを5ミリリットルの洗浄媒体を含む200ミリリットルの円錐形チューブに移します。洗浄液で体積を200ミリリットルまで上げ、以下の洗浄と遠心分離の手順を行います。

次に、膵臓5個分に1枚のプレートを使い、非組織培養処理済みの100ミリペトリ皿にアイレットを均等にプレートします。試験分離全体で、50〜100マイクロメートルビン内の膵臓あたり3,330個のアイレット換算で、中央値アイレットの直径が認められました。自動サイズ測定では合計98,832個の物体が検出され、ゼロ日目に測定された手動まぶたの同等量と強く相関しました。

初日のジトゾン染色に基づく内分泌純度は約98.56%でした。刺激指数は1日目に9.37、3日目に8.34、7日目に6.7で、時点間で有意差はありませんでした。この方法は、アイレット移植、ベータ細胞機能、糖尿病逆転、アイレットカプセル化、アイレット免疫または微小環境との相互作用の研究を可能にします。

このプロトコルは、前臨床移植、糖尿病モデリング、カプセル化研究、高純度のルイスラットアイレットを必要とする体外受精機能アッセイに適用可能です。