Name: 高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-24T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ高齢マウス涙腺の単細胞解離法。コラゲナーゼIVとAccutaseを用いた段階的酵素処理により、線維化した組織から上皮細胞・線維芽細胞・免疫細胞を高生存率で回収し、scRNA-seqとFACSによる分子プロファイリングを可能にする。

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<ol><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+aging-related+diseases%3A+from+molecular+mechanisms+to+interventions+and+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).</li>
<li>Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+dry+eye+disease+in+the+elderly%3A+A+protocol+of+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis.</a> Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).</li>
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<li>Yuksel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+Affects+Lipid+Homeostasis+in+Lacrimal+Glands+by+Upregulating+Lipogenesis+and+Changing+Its+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).</li>
<li>Galletti, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+lymphoid+structures+in+the+aged+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands.</a> Clin Immunol. 248, 109251(2023).</li>
<li>Delcroix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+Gland+Epithelial+Cells+Shape+Immune+Responses+through+the+Modulation+of+Inflammasomes+and+Lipid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism.</a> Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).</li>
<li>Mauduit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+the+lacrimal+gland+features+macrophage+activity+and+epithelium+metabolism+as+key+alterations+during+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation.</a> Front Immunol. 13, 1011125(2022).</li>
<li>Prasad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+Independent+and+Combined+Effects+of+Hyperosmolarity+and+Inflammatory+Stress+on+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).</li>
<li>Scholand, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+Parabiosis+Causes+Dacryoadenitis+in+Young+Lacrimal+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands.</a> Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).</li>
<li>Molla Desta, G., Birhanu, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics%3A+transforming+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research.</a> Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> J Vis Exp. (29), e1266(2009).</li>
<li>Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+tissue+dissociation+techniques+for+cell+manufacturing+single-cell+analysis+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing.</a> Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).</li>
<li>Duong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Human+Lung+Tissue+Dissociation+Protocol+Maximizing+Cell+Yield+and+Minimizing+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Nucleus+RNA-Sequencing+Profiling+of+Mouse+Lung%3A+Reduced+Dissociation+Bias+and+Improved+Rare+Cell-Type+Detection+Compared+with+Single-Cell+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Ikeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+murine+oral+mucosal+tissues+for+single+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications.</a> J Immunol Methods. 525, 113605(2024).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Kahwaji, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKahwaji%2C+N+%22Universal+Precautions%22">Universal Precautions</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).</li>
<li>Delcroix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Transcriptomic+Atlas+of+the+Adult+Lacrimal+Gland+Reveals+Epithelial+Complexity+and+Identifies+Novel+Progenitor+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice.</a> Cells. 12 (10), 1435(2023).</li>
<li>Mauduit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closer+look+into+the+cellular+and+molecular+biology+of+myoepithelial+cells+across+various+exocrine+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands.</a> Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).</li>
<li>Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Myoepithelial+Cells+from+Adult+Murine+Lacrimal+and+Submandibular+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands.</a> J Vis Exp. (148), e59602(2019).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-Mechanical+Procedure+Compared+to+Gentle+Enzymatic+Tissue+Dissociation+in+Cell+Function+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts%3A+a+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Preparing+a+Single+Cell+Suspension+from+Solid+Tissues+for+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).</li>
<li>Lai, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+detaching+adherent+cells+and+their+effects+on+the+cell+surface+expression+of+Fas+receptor+and+Fas+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand.</a> Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><ストロング>マテリアル<ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2(1&nbsp;M解)</td><td>バイオビジョン</td><td>B1010-100</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲナーゼIV</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>ディスパースII</td><td>ロッシュ</td><td>C756V28</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胎児用牛血清、超低IgGです</td><td>ギブコ</td><td># 16250078</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバランスソルトソリューション(HBSS)</td><td>コーニング(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1&nbsp;M解)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン溶液</td><td>コヴェルトゥス</td><td># 11695067772</td><td></td></tr><tr><td>MACS&reg;SmartStrainers(30 & micro;m)</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS&reg;SmartStrainers(70 & micro;m)</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>ミディアム/F12(DMEM/F12)</td><td>ミリポール</td><td>DF-042-B</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MSコラム</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NaCl(5Mストック)</td><td>インビトロジェン&トレード;</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)タブレット</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解液(10回以上)</td><td>ミルテンニ・バイオテック</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>トライパンブルー溶液、0.4%</td><td>Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>超純度EDTA(0.5M、pH 8.0)</td><td>インビトロジェン</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td><強い>抗体<強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD140a(PDGFRA)、モノクローナル抗体(APA5)、APC-eFluorおよびトレード;780、ラット/IgG2a、カッパ</td><td>eバイオサイエンス</td><td>47-1401-82;リッド:AB_2784706</td><td></td></tr><tr><td>FcBlock(CD16/CD32 Fcブロッカー)</td><td>BD バイオサイエンス&nbsp;</td><td>553141;リッド:AB_394656</td><td></td></tr><tr><td>FxCycle&trade;バイオレット・ステイン</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>F10347</td><td></td></tr><tr><td>ラットCD326(EpCAM)-APCモノクローナル抗体(G8.8)、ラットIgG2a、カッパ</td><td>eバイオサイエンス</td><td>17-579182;リッド:AB_2716944</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta2GFP&nbsp;<も></td><td>イヴォ・カラジッチ博士からのご厚意</td><td>PMID: 18571490</td><td></td></tr><tr><td>PdgfraEGFP&nbsp;- B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>リッド:IMSR_JAX:007669</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>装備</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン&トレード;&nbsp;伯爵夫人&トレード;3 自動セルカウンター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A49862;リッド:SCR_026963</td><td></td></tr></tbody></table>

高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、rna配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

Protocol for Single-Cell Dissociation, RNA Sequencing, and Isolation of Myoepithelial Cells and Fibroblasts from the Aged Lacrimal and Salivary Glands

高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

Aging of the lacrimal gland (LG) is associated with reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease. Age-related LG ...

protocol-for-single-cell-dissociation-rna-sequencing-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

臓器特有の感覚ニューロンを特定するのは困難です。Fast...

方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ

このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA...

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

涙腺 (LG) は、α平滑筋アクチン (αSMA): 筋上皮細胞 (MECs) および周皮細胞を発現する2つの細胞型を有する。MECs は外胚葉の起源であり、多くの腺組織に見られる一方、周皮細胞は endodermal 起源の血管平滑筋細胞である。このプロトコルは、マウス LGs から MECs...

成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離

一次ヒト唾液腺由来上皮細胞を分離・培養する方法を提示する.これらの細胞は唾液上皮起源の遺伝子発現パターンを示し、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム腫瘍細胞に由来する基塩膜マトリックス上の唾液圏として、または処理された培養皿上の単層として増殖することができる。...

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。...

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。...

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

現在のプロトコルは、成長し続けるマウス切歯、マウス臼歯、およびヒトの歯から単細胞RNA-seq分析に適した単一細胞を単離するための迅速で効率的で穏やかな方法を提示します。...

マウスとヒトの歯からの単一細胞の迅速な分離

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。...

マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

この記事では、単核RNAシーケンシングを目的としたマウス嗅覚上皮の解剖と解離のための合理化されたプロトコルを提供します。...

単核懸濁液のためのマウス嗅覚上皮の迅速な解剖と解離

このプロトコルは、マウス眼レンズ上皮と線維細胞バルク塊の分離、続いてRNA単離およびqPCR分析を詳述する。この方法により、水晶体細胞コンパートメントを分離して、上皮細胞と分化した線維細胞におけるトランスクリプトームと生物学的プロセスをより詳細に分析することができます。...

マウス眼水晶体上皮および線維細胞バルク塊からのRNA単離

学ぶ高齢マウス涙腺の単細胞解離法。コラゲナーゼIVとAccutaseを用いた段階的酵素処理により、線維化した組織から上皮細胞・線維芽細胞・免疫細胞を高生存率で回収し、scRNA-seqとFACSによる分子プロファイリングを可能にする。

高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

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