高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル
2026年4月24日
このプロトコルは、老化マウスの涙腺を解離し、単一細胞RNAシーケンスのための生存可能な単一細胞を得る最適化方法を説明しています。逐次酵素的消化と穏やかな取り扱いにより細胞の完全性が保たれ、細胞型特異的分離や加成に伴う涙腺集団の変化のトランスクリプトミック解析に適した高品質な懸濁液が得られます。
私の研究室では、唾液や涙腺の加齢に伴う変化が、フローサイトメトリーと単細胞RNAシーケンシングを用いて異なる細胞タイプにどのように影響するかを研究しています。標準的な解離法は、老年した唾液や涙腺から脆弱な上皮細胞を十分に回収できません。そして私のプロトコルは細胞の生存率を向上させ、信頼性の高い単一細胞解析と細胞選別を可能にします。
まず、安楽死したマウスを解剖台に仰向けに配置します。細かい鉗子とハサミを使って、目と耳の間の皮膚を切開します。皮膚を優しく引き戻して涙腺を露出させます。
鈍い鉗子を使って、涙腺を少し持ち上げます。周囲の結合組織を円を描くように優しく引き離し、慎重に分離します。涙腺の目に見える境界を特定し、耳下腺を含む隣接組織から分離します。
その後、涙腺を氷の上で2ミリリットルの冷たいPBSを入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。解剖顕微鏡の下で残った脂肪を取り除き、結合組織のカプセルを慎重に涙腺から取り出します。滅菌された35ミリのペトリ皿を氷の上に置きます。
皿の中央に800〜1000マイクロリットルの冷たいPBSを加え、1つの涙腺をPBSに移します。組織がPBSに浸かっていることを確認してください。2本の滅菌メスを使い、涙腺を細かく細かく刻み、柔らかいペースト状の質感にします。
組織の断片は皿の片側に集めます。残留PBSを吸引し、新鮮な冷水PBSを1ミリリットルで洗浄します。洗浄された組織断片を、1ウェルあたり2ミリリットルの予温消化培地プレートに移します。
皿を揺らす水槽に入れ、37度・60回転毎分で30分間孵化します。広口径の1ミリリットピペットの先端を使い、組織を15回優しく擦砕します。皿をシェイクウォーターバスに戻し、さらに30分間孵化させます。
次に、通常の1ミリリットルのピペットチップを使い、サンプルを10回優しく研磨し、再度30分間培養します。その後、サンプルを10回優しくトリチーし、細胞懸濁液を2ミリリットルのドルフィンマイクロ遠心分離管に移します。プレートの各ウェルに1ミリリットルの冷却ブロッキング培地(BM1)を加え、残留細胞を含む消化培地を回収し、次の工程までプレートを氷の上に置きます。
細胞懸濁液を含むチューブを300Gで4度Cで5分間遠心分離します。各チューブから上清液を捨てます。残留細胞を含むプレートの各ウェルから対応するチューブにBM1を移します。
次に、各ウェルに600マイクロリットルの冷水BM1を加え、残りのセルをすいで洗浄し、ウォッシュを対応するチューブに移してセル懸濁液と結合させます。セルの懸濁液を優しく再懸垂させます。チューブを再び300Gで4度Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
細胞ペレットにアキュターゼを1ミリリットル加え、細胞を優しく再懸浮させます。チューブを37度・毎分60回転で5〜10分間孵化します。1ミリリットルのピペットチップを使い、サンプルを優しく10回乾燥させます。
次にチューブに冷たいBM2を1ミリリットル加え、アキュターゼを希釈して酵素反応を終わらせます。チューブを300Gで4度Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。200単位/ミリリットル濃度のDNase 1を含む培地をチューブに加え、細胞を再懸浮させてチューブの上部まで満たします。
チューブを室温で10分間孵化し、5分後に1回優しく再懸浮させます。その間に、70マイクロメートルのセルストレーナーを15ミリリットルの円錐形チューブの上に置き、ストレーナーに1ミリリットルのBM3をあらかじめ湿らせます。培養後、細胞懸濁液をストレーナーに移します。
元の採取チューブにBM3を1ミリリットル加えてすすいで、同じストレーナーに移します。ストレーナーをさらに5ミリリットルのBM3で洗います。最後に、トリパンブルー染色と自動細胞カウンターを用いてろ過細胞懸濁液の細胞濃度と生存可能性を測定します。
その後、単一細胞RNAシーケンスによる遺伝子発現プロファイリングや、フローサイトメトリーを用いた蛍光標識細胞集団の細胞選別など、次の応用を進めます。単細胞RNAシーケンシングデータのUMAP解析により、尿水体における上皮および間質集団、すなわち筋上皮細胞や線維芽細胞、ならびに多様な免疫細胞集団が特定されました。老化した涙腺には豊富な血漿とIGHMおよびIGHDを発現する活性化されたB細胞が含まれていました。
シーケンシャルフローサイトメトリーゲートにより、EpCAM陽性かつGFP陽性の筋上皮細胞とEpCAM陰性GFP陽性の壁細胞を明確に分離しました。PDGFRアルファを発現するGFP陽性線維芽細胞はEpCAM陰性であり、上皮細胞との識別が可能でした。PDGFRアルファおよびEGFPマウスでは、すべてのGFP陽性細胞もコラーゲン1を発現し、線維芽細胞の同一性を確認しました。
フローサイトメトリー解析の結果、GFP陽性細胞の99.6%がPDGFRα免疫染色細胞に対応していることが示されました。このプロトコルは、上皮細胞、気質体、免疫集団の分子特性解析のために、涙腺から生存可能な単一細胞を分離することを目的としています。主な課題は、脆弱な老化組織の解離時の機械的および酵素的ストレスを最小限に抑えつつ、単一細胞RNAシーケンスにおいて高い細胞生存率を維持することです。
この手順により、単離細胞は単一細胞RNAシーケンシング、バルクRNAシーケンシング、特定の細胞集団の分子プロファイリングに利用可能です。選別された細胞は下流の機能的アッセイのために培養することも可能です。
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Overview
This article presents an optimized protocol for isolating viable single cells from aged mouse lacrimal glands (LGs), enabling high-quality single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and flow cytometry analysis. The method addresses challenges posed by increased fibrosis, cellular fragility, and lipid accumulation in aged LGs, ensuring efficient dissociation and recovery of diverse cell types for downstream molecular profiling.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular biology
- Ophthalmology and exocrine gland research
- Single-cell transcriptomics
Background
- Aging of the lacrimal gland leads to reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease.
- Age-related changes include immune cell infiltration, cellular damage, lipid accumulation, extracellular matrix deposition, and ductal dilation.
- Single-cell RNA sequencing is a powerful tool for profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes during aging.
- Obtaining viable single-cell suspensions from aged LGs is technically challenging due to tissue fragility and fibrosis.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for efficient dissociation of aged mouse lacrimal glands.
- To enable isolation of multiple cell types suitable for scRNA-seq and flow cytometry.
- To minimize cell damage and maximize viability during tissue processing.
Methods Used
- Careful dissection and mincing of lacrimal gland tissue from euthanized mice.
- Stepwise enzymatic digestion using Collagenase IV, Dispase II, DNase I, and Accutase.
- Use of pre-coated plasticware and controlled temperature/agitation to reduce cell stress.
- Red blood cell lysis and sequential filtration through strainers to enhance cell purity.
- Cell type-specific isolation using reporter mouse lines (Acta2GFP and PdgfraEGFP) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) after immunostaining with EpCAM antibody.
Main Results
- The protocol yields high-quality, viable single-cell suspensions from both aged and young lacrimal glands.
- UMAP analysis of scRNA-seq data identified well-represented epithelial, stromal, and diverse immune cell populations.
- FACS enabled clear separation and identification of myoepithelial cells (EpCAM+, GFP+) and fibroblasts (PDGFRα+, EpCAM-).
- In aged LGs, abundant plasma and activated B cells expressing IGHM and IGHD were detected.
- 99.6% of GFP-positive cells corresponded to PDGFRα-immunostained fibroblasts, confirming cell identity.
Conclusions
- This protocol enables efficient and gentle dissociation of aged lacrimal glands for single-cell analysis.
- It supports high cell viability and recovery of multiple cell types, including fragile epithelial and stromal populations.
- The method is adaptable to other fibrotic or aging exocrine tissues requiring targeted cell isolation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient single-cell dissociation and isolation from aged lacrimal and salivary glands addresses a critical bottleneck in profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes associated with tissue aging and fibrosis. This protocol enables high-viability recovery of fragile epithelial and stromal populations, supporting robust single-cell RNA sequencing and targeted cell sorting for discovery-stage research. The method enhances predictive confidence in cell-type specific molecular characterization, informing early target validation and mechanistic de-risking in exocrine gland disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of age-related cellular and molecular changes in exocrine tissues.
- Supports functional target validation by isolating viable myoepithelial cells and fibroblasts for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality single-cell suspensions for transcriptomic profiling.
- Improves predictive confidence in disease-relevant system modeling for dry eye and related disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions suitable for high-throughput scRNA-seq and flow cytometry workflows.
- Standardizes dissociation and isolation steps to maximize reproducibility and quantitative output quality.
- Enables reliable cell-type specific sorting using FACS and reporter mouse lines for assay development.
- Supports scalable adaptation to other fibrotic or aging exocrine tissues with similar dissociation challenges.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling outputs with disease-relevant biomarkers in aged tissue models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional assays on sorted cell populations.
- Reduces biological risk in translational studies by ensuring high cell viability and purity for downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis and targeted cell isolation from challenging aged tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in age-related exocrine gland dysfunction.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity single-cell suspensions for quantitative transcriptomic and cytometric assays.
- Analytics: Provides cell-type resolved molecular data and enables statistical comparison of cellular populations across age groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and functional validation in disease-relevant aged tissue models.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse exocrine tissues, supporting platform scalability and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-type specific analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell workflows in aged and fibrotic tissues.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting exocrine gland dysfunction and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic dissociation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to automated cell counters, FACS instrumentation, and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and sorting protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of enzyme concentrations and incubation times.
- Cell viability and yield may be limited by tissue fibrosis and cellular fragility in advanced aging models.
