酸素供給用途における階層的多孔質UiO-66ナノ粒子における合成、ヘモグロビン封装および双直交PEG化

本研究の目的は、ヘモグロビンカプセル化および酸素供給のためのMOFベースの安定した金属有機フレームの定義です。階層多孔性形態はヘモグロビン被覆の後のサイズ制限を克服でき、表面集団は生理的環境下での粒子の安定性を高めることができます。まず、準備された階層的に多孔質のUIO 66アミンナノ粒子50ミリグラムを25ミリリットルの丸い底フラスコに正確に計量します。

フラスコにテトラヒドロフランを10ミリリットル加えます。その後、混合物を超音波で5分間加熱し、粒子を完全に分散させ、均一な不透明な懸濁液を作り出します。丸底フラスコを氷水浴に浸し、400回転に設定した磁気攪拌器に入れます。

ガラス注射器を使い、5分間にわたり0.4ミリリットルのtert butyl亜硝酸塩を滴下に加え、温度を5度以下に保ちます。同じ冷温条件下ですぐにトリメチルSLアジドを0.35ミリリットルずつ滴り加えます。軽い発泡が現れることがあり、窒素化の進行を示します。

その後、氷水浴をアルミホイルで包んで反応を光から守ります。反応混合物を氷水浴で一晩かき混ぜ続けます。翌日、写真通りに洗って乾かします。

その後、FTIR分光法を使って化学変換を検証します。階層的に多孔質のUIO 66アジドナノ粒子5ミリグラムを2ミリリットルの遠心分離管に移します。HEPESバッファーを0.5ミリリットル加え、2〜5分間ソニックテージします。

ヘモグロビン20ミリグラムを含むHEPESバッファーを0.5ミリリットル追加し、チューブを数回優しく反転させてナノ粒子を完全に拡散させます。次にチューブをサーモシェーカーに置き、室温で1,000回転で振って2時間培養します。培養後、13,500 Gの温度で室温で5分間遠心分離し、階層的に多孔質なヘモグロビンを充填したUIO 66アジドナノ粒子をペレットします。

その後、上清液を慎重に採取し、閉じ込められていないヘモグロビンの定量を行います。ペレットを1ミリリットルの超純水で優しく3回洗い、ピペットで上下に動かして緩く吸収されたヘモグロビンを除去します。その後、各洗浄液の上澄液を慎重に採取し、閉じ込められたヘモグロビンの定量を行います。

最終ペレットを0.5ミリリットルの超純水に再懸濁し、特性評価前に冷蔵庫で保存します。硫酸ナトリウムローレルヘモグロビンアッセイを用いて、収集した上清液中に閉じ込められたヘモグロビンを特定します。上清液10マイクロリットルを96ウェルマイクロプレートにピペットで抽出します。

硫酸ナトリウム100マイクロリットルを加え、暗闇の室温で5分間培養します。紫外線可視光分光光度計を用いて、412ナノメートルの吸収を測定します。その後、HEPESバッファー内のヘモグロビンストックを連続希釈して標準曲線を作成します。

調製済みの希釈液を準備された96ウェルプレートに移し、吸収度測定値をヘモグロビン濃度に変換するための標準曲線を作成します。階層的に多孔質なヘモグロビンを含んだUIO 66アジドナノ粒子10ミリグラムを、0.5ミリリットルの超純水を含む2ミリリットル遠心分離機管に移し、2〜5分間超音波処理を行います。ポリエチレングリコールで修飾したジベンゾシクロオクタン20ミリグラムを加え、ポリエチレングリコールとナノ粒子の等モル比を得ます。

チューブ内を優しく渦巻き、混合物が均質化されるまで調整します。チューブをサーモシェーカーに置き、室温で1,000回転/分の振るまま1時間孵育します。その後、チューブを4度の温度で冷蔵庫に入れて一晩反応させます。

チューブを12,000Gで室温で5分間遠心分離し、ポリエチレングリコール修飾、ヘモグロビン充填、階層的に多孔質なUIO 66ナノ粒子をペレット状にします。その後、反応性の低いポリエチレングリコールを含む上清液を廃棄します。ペレットを2ミリリットルの超純水で3回洗浄し、ピペットで上下にし、前述の条件で遠心分離します。

精製されたペギル化ヘモグロビンを含み、階層的に多孔質なUIO 66ポリエチレングリコールナノ粒子を、2ミリリットルの超純水に再懸濁します。サスペンションは4度の温度で保管してください。その結果得られるコロイドは均一でやや乳白色をしており、良好な分散安定性を示しています。

次に動的光散乱(DLS)によるペジル化の成功を確認します。表面アミノ基はアジドに成功裏に変換されました。これは、階層的に多孔質なUIO 66アジドナノ粒子のFTIRスペクトルで2,122センチメートルの逆方向に特徴的な非対称アジド伸縮帯の出現によって示されました。

このバンドは階層的に多孔質なUIO 66アミンナノ粒子には存在しませんでした。ヘモグロビンの被覆は、明確な黄色から赤色への変化によって視覚的に示されました。ヘモグロビンの負荷後、窒素の取り込みが減少し、ヘモグロビン分子がメソポアを占有していることを示しました。

階層的に多孔質なUIO 66アジドナノ粒子のゼータ電位は、ヘモグロビン被覆後に42.9ミリボルトから20.4ミリボルトに減少しました。ポリエチレングリコールの共役が成功したことは、2,122センチメートルの逆センチメートルでのアジド伸縮振動の消失と、FTIRスペクトルにおけるポリエチレングリコール関連信号の出現によって確認されました。DLS解析により、ペジル化後、流体力学的直径が約114.9ナノメートルから140.8ナノメートルに増加し、低いPDIを維持していることが示されました。

この粒子は階層的に多孔質な形態ナノ粒子の合成、ヘモグロビンカプセル化、表面ペキュレーション、酸素放出機能の評価を可能にします。このプロトコルを用いることで、追加の物理化学的特徴付けや機能的研究が行われ、in vitro酸素放出やナノ粒子生体適合性の分析も含まれます。今後の研究では、ヘモグロビン機能の長期的な保存に焦点を当て、実質的な劣化を防ぐ成分の組み込みなどが検討されます。