Name: AAV導入研究における3Dスフェロイドの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぼう、3Dスフェロイドを用いたAAV導入効率と遺伝子発現動態の定量的評価法。超低接着プレートで均一な球体を作製し、蛍光・ルミネセンスレポーターによるリアルタイムモニタリングでベクター最適化と前臨床評価を支援します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者らは、AAV nanoluciferase製造用プラスミドおよび生細胞用基質試薬を提供してくださったMorten Seirup氏とTrish Hoang氏に感謝いたします。本プロジェクトは、米国エネルギー省とFDAの間の機関間協定に基づき、Oak Ridge Institute for Science and Educationが運営する、米国食品医薬品局（FDA）CBERでのORISE Research Participation Programへの任命により支援されました。

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

本稿では、AAVの開発および力価試験のための効率化されたin vitro&#160;3Dプラットフォームを提示します。このプラットフォームは、ヒト組織の構造をより密接に模した三次元細胞培養を用いることで、形質導入の強化、高感度化、および翻訳予測性の向上を実現しています。本システムは、複数の細胞株において、シングルストランドおよびセルフコンプリメンタリーベクターを含む、AAVセロタイプや調節エレメント間の形質導入効率の差を正常に識別することに成功しました。なお、形質導入効率を導入遺伝子陽性細胞の割合として定義することが多い従来の2Dアッセイとは異なり、3Dスフェロイドシステムでは単一細胞レベルでの定量が容易ではないことに留意してください。したがって、本研究における形質導入効率は、導入細胞の割合と細胞あたりの導入遺伝子発現レベルの総合的な寄与を反映する、バルクのレポーター信号強度（蛍光または発光）として定義しています。スフェロイドの高い感度により、必要となる産物量を大幅に削減でき、AAVの研究開発においてコスト効率が高く、汎用性があり、生理学的に妥当な手法となります。
このアプローチは、従来の2D細胞培養アッセイにおける主要な課題を解決します。従来の2Dアッセイは人工表面への接着に依存しており、細胞組織化が不十分であるため、臨床現場におけるベクターの性能予測の精度が低くなる可能性があります&#160;。3Dスフェロイドシステムは組織構造や薬物分布パターンをより適切に模倣できるため、実際の生物学的条件により近いベクター挙動のデータを提供します22,23。本プロトコルでは簡便な超低接着プレートを使用するため、標準的な研究室環境で容易に再現可能です。
この適応性の高いシステムは、AAVの中和試験やAAVの浸透研究、さらに異なる細胞環境がAAVの形質導入に及ぼす影響を調べるための、より複雑な共培養実験の開発に利用できる可能性があります。加えて、ハイスループットな薬剤およびベクターのスクリーニングプラットフォームをこのスフェロイドプラットフォームに容易に統合できるため、より標的を絞った製品開発に向けたベクター探索ワークフローの自動化とコスト削減が可能になります。
スフェロイドの大きな実用的利点は、細胞の継代なしに数週間にわたって連続的に成長させることができるため、AAV活性の長期的な研究が可能になることです。この安定した培養システムは、重要な細胞間相互作用とマトリックス成分を維持し、2D培養で必要となる繰り返し細胞回収による中断を回避します24。維持された細胞環境は、AAVの細胞への結合および侵入を評価するために不可欠な、天然のタンパク質組織化と膜構造をサポートします25。
3DスフェロイドはAAV導入効率の評価において大きな可能性を示していますが、天然組織と比較して構造が簡略化されているため、in vivo&#160;モデルと比較すると翻訳上の欠点もいくつか存在します。スフェロイドには、ベクター輸送を担う血管系、免疫原性を評価するための免疫細胞、および血液脳関門のような組織特異的なバリアなど、AAVの性能に大きな影響を及ぼし得る重要な生理学的構成要素が欠けています26。これらの制限は、スフェロイドが従来の2D培養とin vivo動物モデルの中間的な複雑さを提供しているものの、包括的なAAV評価に必要な生理学的微小環境を完全に再現するには不十分であることを示しています。
ここで提示するスフェロイドのプロトコールは、一度に1種類の細胞を用いる方法について記述しています。このプロトコールを拡張して、基本的な三次元構造へと凝集する2〜3種類の追加細胞を含めることも可能です。オルガノイドやマイクロ流体デバイスなどのより複雑な3Dモデルは、組織のようなパターンで配置された10種類以上の異なる細胞を含み、特定の臓器の細胞多様性と組織化を再現する多細胞システムです。このような高度な3Dオルガノイドには、多種の細胞27、ハイドロゲル埋蔵培養、吊垂滴法、およびマイクロ流体プラットフォーム11,27,28が含まれます。これらの手法は、AAV生物学の理解をさらに深めるのに役立つより複雑な組織構築を可能にしますが、より専門的な試薬や装置、および相当な技術的専門知識を必要とする傾向があります。一方で、超低接着プレートで形成される3Dスフェロイドは大幅に簡便であり、コスト効率と再現性に優れているため、多くの研究室に適しています。
本プロトコルを適切に実施するための重要なステップには、高い細胞生存率の維持が含まれます。細胞の状態が悪化すると、スフェロイドの形成や導入効率が損なわれる可能性があるためです。また、スフェロイドの凝集性を高めるには、超低接着プレートの使用と遠心分離の最適化も極めて重要です。弱いシグナルや飽和を避けるためには、細胞種およびAAVセロタイプごとにMOIを最適化することが不可欠です。さらに、適切な検出方法の選択も重要であり、特にキネティック解析においては、連続的なライブセルイメージングシステムとの互換性が求められます。3DスフェロイドにおけるAAV導入を正確に解釈するためには、いくつかの技術的な検討事項が重要となります。
導入シグナルが弱い、あるいは認められない場合は、ウイルスタイターの低さ、不適切なMOI、またはインキュベーション時間の不足が原因である可能性があり、これらはウイルスタイターの確認、MOIの最適化、およびインキュベーション時間の延長（通常3～5日間）によって対処できます。蛍光または発光シグナルが弱い場合は、トランスジーンの発現レベルが低いか、3D構造内への試薬の浸透が不十分であることが考えられ、露光設定の最適化や基質の拡散に十分な時間をかけることで改善できます。HeLa細胞などの特定の細胞株における大きな課題は自己蛍光であり、これにより蛍光ベースのアッセイにおいて背景シグナルが高くなり、感度が低下することがあります。この制限に対処するため、我々は発光ベースのnanoluciferaseレポーターシステムを導入しました。これにより、S/N比が向上し、自己蛍光のある背景下でもより正確な導入検出が可能になります。さらに、不適切な閾値設定や培地由来の蛍光によって背景シグナルが生じることがあるため、未処理のウェル（MOI = 0）を用いてベースラインを定義し、制御する必要があります。最後に、高いMOIでは、過剰なウイルス量または検出器の限界によりシグナルの飽和が起こる場合があります。これは、MOIの範囲を狭め、検出器の露光設定を最適化して、測定値を線形ダイナミックレンジ内に維持することで軽減できます。
全体として、この3Dスフェロイド手法は、AAVの形質導入、効力、およびキネティクスを評価するための効率的で再現性のあるシステムを提供します。従来の2Dアッセイとin vivo研究のギャップを埋めることで、より的確なベクター開発を可能にし、臨床的に意義のある遺伝子治療戦略の進展を支援します。

AAVベクターは、その安全性と持続的な遺伝子発現を達成できる能力から、in vivo応用のための好ましい遺伝子導入システムの一つとなっています1。AAV遺伝子治療は、数百もの製品が開発パイプラインにあり、複数の希少疾患の治療において成果を上げています2。さらに、Cas9などのゲノム編集コンポーネントのin vivo導入といった新たな応用が進んでおり、治療が困難な適応症の治療を支援する大きな可能性を秘めています3。開発における主な課題には、高い製造コストや、製品の品質および臨床的有効性を判断するための現在のin vitroアッセイの予測能が限定的であることなどが挙げられます4。
AAV治療薬の進展は、臨床的なパフォーマンスを正確に予測できる、標準化された予測能の高い活性アッセイの欠如によって根本的に制限されています4,5。これらのアッセイは、設計されたベクターライブラリのスクリーニング、標的能を向上させるためのカプシド修飾の最適化、および組織特異的な親和性の評価など、多目的に利用されるため、開発パイプラインにおいて極めて重要な構成要素となります。また、調節配列が導入遺伝子の発現に及ぼす影響を特性評価する役割も担っています6。候補の選定に留まらず、AAV形質導入アッセイは、ロットリリース、ロット間比較試験、および安定性評価に用いられる力価試験を通じて、製造上の重要な品質管理をサポートしています6,7。
科学的な課題は、日常的な使用における実用的な実現可能性を維持しつつ、ベクターと宿主の相互作用の複雑さを捉えるアッセイを開発することにある7,8。現在のアプローチには、従来の2D単層培養において標的臓器を代表する不死化細胞株を利用することが含まれる。これらの培養条件は生理学的な妥当性に欠け、高用量の薬剤を必要とする。これにより、研究室での予測と臨床への転用可能性との間に大きな乖離が生じている。AAVR過剰発現系やCRISPR活性化システムなどの新規エンジニアリング細胞株は重要な進歩を示しているが、天然組織に特徴的な三次元構造や細胞外マトリックスの相互作用を再現することはできていない9,10,11。in vivoの微小環境をより適切にシミュレートできる次世代モデルは、この転用上の隔たりを埋める可能性がある12,13,14。
我々は最近、AAV導入アッセイのトランスレータビリティを向上させるため、AAV導入に最適化した3Dスフェロイドシステムを開発しました。このシステムは、ゴールドスタンダードである2Dアッセイと比較して、複数の細胞株およびAAVセロタイプにおいてAAV導入効率を大幅に向上させます。感度の向上とアッセイに使用する産物の節約に加え、これらのモデルは、スフェロイド内の細胞の位置に応じて変化する現実的な細胞間相互作用を提供することで、2D単層培養を改善しています。また、実際の臓器の状態を模倣した薬剤浸透の有意義な調査も可能です11,15,16。さらに、このスフェロイドアプローチは、標準的な研究室設備を使用し、特殊な培地やスキャフォールドの要件を回避できるため、より複雑なオルガノイドや共培養システムよりも実用的な利点があります。この簡便さにより再現性とスケーラビリティが確保され、ルーチンの遺伝子治療試験やベクター開発のワークフローに適しています17。
この3Dスフェロイドプラットフォームは、低用量でのAAV導入の高感度な検出や、ベクターゲノム設計の比較評価を必要とするアプリケーションに特に適しています。また、セロタイプ依存的な向性の評価も可能です。従来の2D培養において高用量のAAVを必要とする、導入効率が比較的低い細胞株に特に有用です。このような状況では、3Dプラットフォームによる感度の向上と生理的妥当性の改善が極めて重要となります。ただし、免疫成分、血管輸送、または完全な組織の複雑性を必要とする研究には、このシステムは適さない場合があります。これは、スフェロイドではin vivo&#160;環境を完全には再現できないためです。
したがって、本稿では、AAV導入アッセイに最適化された簡便な3Dスフェロイドプロトコルを提示します。本プロトコルでは、導入効率（ここではスフェロイドあたりの総レポーター信号として定義）と導入キネティクスという、重要かつ相補的な2つの読み取り値を用います。この手法は、AAVの力価評価、ベクター設計、および中和アッセイのための、費用対効果が高く、生理学的に適切で、有益なプラットフォームを提供します。

<table><tbody><tr><td>37℃インキュベーター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>標準的な培養条件</td></tr><tr><td>A375細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>AAV1プラスミド</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAVプラスミド</td></tr><tr><td>AAV2プラスミド</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAVプラスミド</td></tr><tr><td>AAV5プラスミド</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAVプラスミド</td></tr><tr><td>AAV8プラスミド</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAVプラスミド</td></tr><tr><td>AAV9プラスミド</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAVプラスミド</td></tr><tr><td>BioTek GEN5 プレートリーダー</td><td>Agilent Technologies</td><td>該当なし</td><td>蛍光または発光のエンドポイント読み取り</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>スフェロイド懸濁液の維持</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; 細胞培養用リン酸緩衝生理食塩水 (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>細胞洗浄用PBS</td></tr><tr><td>高グルコースDMEM、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>完全増殖培地</td></tr><tr><td>細胞外NanoLuc阻害剤&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>あらゆるNanolucを消光する&amp;reg; 細胞外環境から届くシグナル&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>成長因子を添加する</td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>HEP3B細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>HepG2細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>Huh7細胞</td><td>エージェントベースモデル</td><td>T8973</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 倒立顕微鏡</td><td>Sartorius</td><td>提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストを入力してください。</td><td>スフェロイドの形成および成長のモニタリング</td></tr><tr><td>IVIS Spectrumイメージングシステム</td><td>スペクトル・インビボ</td><td>該当なし</td><td>ルミネッセンスのエンドポイント読み取り</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; 生細胞アッセイ&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>生細胞検出用ルミネッセンス基質試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>細菌汚染の防止</td></tr><tr><td>通気孔付きT75組織培養フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>細胞培養用フラスコ</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>細胞の酵素的剥離</td></tr><tr><td>超低接着プレート</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>スフェロイド形成を促進するための細胞接着の防止</td></tr></tbody></table>

aav導入研究における3dスフェロイドの評価

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子治療製品における遺伝子導入に使用される強力なベクターです。その開発には、ベクター設計、セロタイプによる性能、調節エレメントの強度、および発現キネティクスの違いを確実に検出できるin vitro&#160;システムが必要です。また、これらのシステムは、力価評価やベクター最適化などのアプリケーションをサポートしなければなりません。本稿では、多様な細胞株においてAAVの力価、導入遺伝子の発現キネティクス、およびセロタイプ特異的な導入効率を評価するために最適化された、効率的な三次元スフェロイドプラットフォームについて説明します。超低接着プレートを用いて均一なスフェロイドを形成し、安定した構造と長期イメージングを維持できる条件下で培養します。AAV導入後、ライブセルイメージングシステムを用いて、蛍光または発光のリードアウトをリアルタイムでモニタリングします。これにより、連続的なキネティックイメージングを通じて、リポーターシグナル、用量反応性、調節エレメントの活性、および発現開始時間の定量的な評価が可能になります。本プラットフォームは、強力なベクターゲノム設計と弱い設計、および複数のAAVセロタイプを効果的に区別します。この手法は、緩徐に分裂する細胞株と急速に分裂する細胞株の両方において堅牢な性能を示します。これらの結果は、本システムが前臨床段階の遺伝子治療の評価および開発において、スケーラブルで生理学的に妥当なシステムとして有用であることを立証しています。

3次元スフェロイド培養システムは、AAV遺伝子治療の開発において従来の2Dモデルよりも優れた特性を有しています。本手法により、低用量でのAAV導入の高感度な検出、生理学的妥当性の向上、および堅牢な長期モニタリングが可能になります。このプラットフォームは、多様な細胞株やAAVセロタイプにおける力価評価、ハイスループットスクリーニング、およびベクターの最適化を支援します。

AAV導入研究における3Dスフェロイドの評価

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子治療製剤における遺伝子導入に用いられる強力なベクターである。その開発には、...を可能にするin vitroシステムが必要である。

We developed a sensitive, physiologically relevant 3D spheroid platform to evaluate AAV transduction activity and improve the prediction of vector performance for gene therapy. This protocol is applicable for evaluating AAV activity in vector potency testing, serotype screening, transgene optimization, neutralization studies, and in vitro preclinical gene therapy.To start, grow the cells in a T75 cell culture flask until they reach 70% confluency under standard conditions. After trypsinizing the cells, prepare a 1 to 10 dilution for routine cell passaging. Incubate the cells again until they reach 70% confluency, then harvest them. After assessing cell viability, thoroughly pipette the cell suspension to ensure it is well mixed. Perform two-fold serial dilutions of the cells in an ultra-low attachment 96-well plate, starting with 1 times 10 to the power of 4 cells per well in 200 microliters. Following the experimental layout shown, add 1 volume of complete medium to all rows except the top row. Then add two volumes of 1 times 10 to the power of 4 cells per well in the top row. Serially dilute row 1A by adding one volume of row 1A into row 1 B, and continue in the same manner. Centrifuge the ultra-low attachment plate at 350 x g for five minutes to pull the cells to the center and promote cell-to-cell contact. Incubate at 37 degrees Celsius, undisturbed for 24 to 48 hours for spheroid formation. Allow three days for the diameter to reach about 400 micrometers. Check spheroid size uniformity, ensuring cells are resuspended evenly and plates are flat. Monitor spheroid morphology. Select mature spheroids that exhibit tight cell-to-cell adhesion rather than loose cell aggregates.Once the cell suspensions are spun down, transfer the plate to a 37 degrees Celsius incubator equipped with a live-cell imaging instrument. Log in to the acquisition software. Select Schedule to acquire and Scan on schedule, then select Create vessel to New. Then choose scan type and select spheroid. Pick the channels of interest. Select phase with bright field. Then choose green or red. Set the desired magnification to 10x. Pick the plate model and its position in the drawer. Select the wells to image and enter the experiment name. For the analysis setup, select Differ analysis until later. Set scans to be added every six hours and scan indefinitely. Check daily for spheroid growth by logging into the imaging software. Select View recent scans and double-click on the desired experiment. After selecting Brightfield in the image channels panel, use the Measure image feature to measure the diameters of the spheroids. Remove the plate on the day of optimized spheroid formation and use it for adeno-associated virus, or AAV, transduction.Prepare a 96-well round bottom plate containing 297 microliters of 2% FBS-supplemented DMEM without antibiotics. Add 33 microliters of AAV stock to the medium to obtain a starting multiplicity of infection, or MOI, of 1 times 10 to the power of 6. Then prepare 10-fold serial dilutions by transferring 33 microliters of each dilution into 297 microliters of medium. Aspirate all medium from the previously prepared spheroid plate using a multichannel pipette. Transfer 100 microliters of the desired MOI of AAV from the dilution plate to the treatment plate using a multichannel pipette. Place the plates back into the imaging instrument. Start monitoring transduction by tracking green fluorescent intensity over 72 hours. Add 100 microliters of complete DMEM per well every three days to replenish nutrients. Place the plate back in the imaging instrument and start recording transduction efficiency every six hours. Analyze the data by creating an analysis definition specific to the cells and reporter genes of interest. Perform endpoint analysis using fluorescence readouts. Similarly, perform AAV transduction in 3D spheroids with luminescent reporters, followed by transduction analysis using bioluminescent imaging.Each cell line exhibited distinct morphological features and varying levels of compaction after three days of seeding. Hepatic cell lines formed more compact, denser spheroids than other cell lines. HEK293T formed a very round spherical appearance with a distinct necrotic core. A375 formed an irregularly shaped cell aggregate. Spheroids were highly susceptible to AAV transduction, with strong transduction detected at very low AAV titers across different cell lines for self-complementary GFP. Spheroid transduction of single-stranded GFP was observed at lower levels than self-complementary GFP. A 100-fold difference in relative fluorescence was observed between the self-complementary and single-stranded transgenes at a MOI of 10 to the power of 6 in HEK293T cells. A three-fold difference in relative fluorescence was observed between the self-complementary and single-stranded transgenes in HEP3B cells. All four AAV serotypes were successfully detected using both the fluorescent plate reader and the live-cell imaging system. AAV2 showed the highest transduction efficacy, followed by AAV1 in both cell lines. All AAV serotypes showed efficient transduction using the luminescent system, enabling precise differentiation of transduction efficacy. AAV2 was the most effective serotype in HeLa spheroids, while AAV9 had the lowest transduction efficacy. AAV2 self-complementary GFP transduction was detectable at infection rates as low as 10 to the power of 1, with a noticeable increase in signal after about 34 hours compared to untreated cells. The AAV2 single-stranded GFP signal was weaker and slower than the self-complementary GFP signal.The key challenge when performing this protocol is maintaining high cell viability, producing uniform, compact spheroids, and optimizing AAV dosing for each cell type and serotype. This protocol can assess transgene expression and functionality using RT-qPCR, Western blotting, ELISAs, and somatic activity assays, and onset time kinetic analysis. Future studies can incorporate co-cultures, organoids, microfluidics, immune cells, or vasculature to better mimic the in vivo microenvironment.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、我々はヒト肝癌細胞を標的とするための最も効率的なベクターとしてアデノ随伴ウイルス3型（AAV3）の識別について説明します。...

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。...

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

網膜疾患の動物モデルにおける血液網膜関門透過性と内部制限膜の完全性を調査するために、我々は網膜ニューロンとグリアを標識するためのツールとしていくつかのアデノ随伴ウイルス(AAV)変異体を使用しました。その後、ウイルス媒介レポーター遺伝子発現を網膜バリア透過性の指標として使用します。...

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1)...

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。...

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。...

HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。...

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。...

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

このレポートでは、マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子導入のための腎盂 を介した AAV...

アデノ随伴ウイルスベクターの低速逆行性腎盂注射 による マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子送達

学ぼう、3Dスフェロイドを用いたAAV導入効率と遺伝子発現動態の定量的評価法。超低接着プレートで均一な球体を作製し、蛍光・ルミネセンスレポーターによるリアルタイムモニタリングでベクター最適化と前臨床評価を支援します。

AAV導入研究における3Dスフェロイドの評価

さらに動画を探す