凍結バフィーコートサンプルからの誘導多能性幹細胞株の再プログラミング

このプロトコルの目的は、ヒトの凍結バフィーコート(PBMC)を誘導多能性幹細胞に再プログラムすることです。このプロトコルは解凍後にバフィー被毛を唯一に精製し、再プログラミング成功を示す体細胞の形態を特定します。まずは、人間の血から得られた冷凍のバフィーコートを回収し、氷の上に置く。

サンプルを37度の水浴で優しく回し、小さな氷結晶だけが残ったときにバイアルを取り出します。バイアルの内容物を慎重に滴り下がって、12ミリリットルのDPBSが入った円錐形のチューブに移します。バイアルを1ミリリットルのDPBSで洗い流し、回収した細胞を入れた円錐形チューブにリンスを加えます。

スイングバケットローターを使い、200gの室温で10分間遠心分離します。上清液を慎重に除去し、細胞ペレットを1%FBSを含むDPBS4ミリリットルに再懸浮させます。次に、バフィーコート混合物を3ミリリットルの密度勾配溶液の上に優しく重ね、界面での混合を防ぎます。

800gのスイングバケットローターを使い、ブレーキを外したまま室温で20分間遠心分離機を使います。ピペットを使い、プラズマと勾配の界面を乱さずに上部プラズマ層を除去・廃棄します。次に、界面で末梢血単核細胞(PBMC層)を除去し、きれいな15ミリリットル管に移します。

PBMCを洗うには膨張培地3ミリリットルを加え、200gで室温で10分間遠心分離します。上清液を慎重に除去し、SCF、IL-3、EPO、IGF-1などのサイトカインを含む膨張培地2ミリリットルに再懸濁させます。セルは12ウェルプレートのうち1つのウェルにメッキします。

細胞を37度Cで、5%二酸化炭素と20%酸素を10〜14日間培養します。培地の半分を隔日で交換し、明るく丸い紅血芽細胞が密集して現れ、細胞が伝達の準備が整ったことを示します。山中因子を含む仙台ウイルスによる転用から3日後、細胞をマウス胚線維芽細胞に1ウェルあたり2ミリリットルでプレートします。

培養を約7日間インキュベートし、隔日で新生コロニーにhESC培地を与えます。誘導された細胞と浮出したコロニーを含むプレートを解剖顕微鏡の下に置きます。顕微鏡を使って一つのコロニーを特定し、プレートの蓋を持ち上げて井戸を露出させます。

無菌的に注射器を開けて針を露出させます。顕微鏡の誘導に従い、針先でコロニーの輪郭をなぞって周囲の給餌細胞から群落を切り離します。針先で群生地をいくつかの等大きさの大きさの小片に切ります。

ピースがまだ外れていない場合は、針の側面を使って板からすくったりこそげたりして浮かせます。次にP200ピペットを使い、ピックしたコロニーを顕微鏡で見つけ、ピペットで浮遊コロニーを吸引し、準備済みの24ウェルプレートのウェルに移します。他のコロニーやフィーダー細胞を採取せずに、コロニー全体を移植することを確認しましょう。

プレートを37度の温度でインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素と20%の酸素を含み、望ましい合流に達するまで放置します。大きく丸く、縁が光る群れは分裂寸前と識別しましょう。ウェルから培地を吸引し、1ミリリットルのDPBSで試料を一度洗浄します。

次にDPBSを除去し、0.5ミリモラEDTA解離バッファーを500マイクロリットル追加します。サンプルを37度の温度で5%二酸化炭素とともに2分間培養し、コロニーが緩み細胞が丸まるまで待つ。次に、培養皿をインキュベーターから取り出し、EDTA解離バッファーを吸引します。

P1000ピペットを使い、ヒト多能性幹細胞培地1ミリリットルで優しく上下にピペットし、コロニーが剥離しわずかに砕けるまで採取します。培地と細胞の1ミリリットルを新しい6ウェルプレートに移し、そのプレートには新鮮なヒト多能性幹細胞培地1ミリリットルを含みます。細胞を37度の温度でインキュベーターに入れ、二酸化炭素5%、酸素20%を含みます。

井戸が合流して分裂できるまで、誘導多能性幹細胞を毎日供給してください。その間に、DPBSで調製した5マイクログラム/ミリリットルのビトロネクチン溶液を7ミリリットルの7ミリリットルを10センチメートルの皿にコーティングし、室温で1時間培養します。分解を続けるには、10センチメートルの皿に7〜10ミリリットルのヒト多能性幹細胞培地を加え、6枚ウェルプレートから皿に1:1の比率で細胞を移し、先に示したように培養します。

10センチの皿の細胞が合流していることを確認してから、再び分割してください。細胞の形態や密度に基づいて分割比を調整し、通常は1:10の比率で、各通路での通路番号を記録します。最後に、免疫蛍光を用いて幹性マーカーNANOGの発現を確認し、誘導多能性幹細胞の特徴付けを行います。

定義された培養条件を用いて細胞を外胚葉、中胚葉、内胚葉系統に分化します。PAX6、ブラキュリー、SOX17の染色による分化可能性と、NANOG発現の喪失を評価します。拡張の終わりに、PBMCは赤血芽細胞に分化し、大きくて小さな細胞の明るく丸い細胞として現れます。

一方で、これらの細胞を欠いているか死んでいるように見える培養は、再プログラムに成功する可能性は低いです。成功したトランスダクションと再プログラムは、放射線を受けたフィーダー細胞上に誘導多能性幹細胞コロニーの出現によって特徴づけられ、これにより典型的な幹細胞形態が発達しました。一方、幹細胞様の形態を採用しない細胞は成功裏に再プログラムされませんでした。

成功裏に再プログラムされた誘導多能性幹細胞は、滑らかで明るい縁を持つ密集した円形コロニーを示しました。自発分化や中心の密度が高いなど、理想的な形態があまりないサブクローンは、分割条件の調整によってクリーンアップされました。選ばれた植民地の中には成功裏に拡大できなかったものもあります。

形態学に加え、誘導多能性幹細胞は幹性を示すように、幹性マーカーNANOGの発現によって示されました。再プログラムされた誘導多能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉への分化の可能性を示しました。このプロトコルは、再プログラミングの成功を追跡・予測するための詳細なチェックポイントを提供します。

iPSCラインの使用が適切かどうかさらに確認するために、核型解析、ジェノタイピング、定期的なマイコプラズマ検査を行うべきです。このプロトコルにより、バイオバンクされたバフィーコートを持つ既存の患者集団から再プログラムが可能となり、iPSC技術の応用範囲が広がります。