溶液NMRを用いた生体分子凝縮の特性評価

私たちは生体分子凝縮体を研究するためのNMR法を開発しました。これらは細胞の組織化に重要ですが、その情報は複数の障害に含まれます。当社の手法を用いて、凝縮液の性質を調査し、その形成メカニズムを解析し、凝縮液の成熟や生体分子の病的細動などの長期的な変化を監視します。

まず、アガロースヒドロゲルで安定化した最終的な二相サンプルを、それぞれの温かいアガロース緩衝液と混合し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで準備します。最終的なタンパク質、すなわちRNA濃度は通常、NMR検出で50〜500マイクロモルです。準備済みの二相サンプルを分光器に挿入し、通常通りプロトンチャネルをロック、シム、マッチング、チューニングします。

一般的な校正手順を用いて陽子チャネルの90度パルス長を校正します。次に、一次元で水を抑制したスペクトルを記録し、そのスペクトルに強い生体分子信号が含まれているかを確認します。信号がほとんどまたは検出されない場合は、REDIFINEは使用せず、代わりにCONDENSE-MTを使用してください。

拡散順序分光実験を記録し、拡散勾配強度を2%から95%まで16段階で配列します。REDIFINEセット全体のデータを引き続き取得するには、先ほど実施された初期実験のパラメータをコピーして、9つの新しいステップPPP GPQ S19実験を作成してください。各実験では、D20拡散遅延のみを可変段階で変化させ、範囲を100ミリ秒から1000ミリ秒まで広げます。

これらの実験を適切なコマンドで実行してください。最後のNは10実験を通じて受信機の利得を保持するために使います。Q SignをSSB2のウィンドウ機能として設定します。

その後、適切なコマンドで5番目のスライスを抽出します。一次元スペクトルをフェーズし、位相パラメータを二次元データセットに保存します。二次元データセットをXF2で処理し、ABS2でベースライン補正を行います。

その後、16枚のスライスを分割2Dで抽出します。残りの9つの実験にも同様の手順を繰り返します。最初の4〜5枚のスライスは、正しい位相と基準修正を確認するために必ず確認してください。

必要に応じて、フェイジングと基準値を手動で修正してください。その後、適切なMATLABコードを分析に使います。コード内で拡散時間を修正し、プローブの勾配強度に応じてPG値を設定し、実験総数に基づいて1から10までを割り当てます。

その後、このコードを使ってREDIFINEモデルに従ってデータをフィッティングします。1次元水抑制スペクトルを記録します。信号が非常に少ない場合は、CONDENSE-MT実験を進めてください。

定量的CONDENSE-MTのためにT1反転回復による水のR1速度を求める。提供されたパルスシーケンスとVDリストをそれぞれのフォルダにコピーします。陽子90度パルスを校正した後、NSを2、DSを0、D1を20秒、SWを10ppmに設定します。

TD2から16K、TD1から24へ。CONDENSE-MT実験では、提供されたBrukerパラメータセット、シーケンス、周波数リストをBruker専用フォルダにコピーしてください。その後、分光器に応じて周波数と出力を調整します。

P1は校正された90度パルス長に、P4は励起パルスとして1マイクロ秒に設定し、放射線減衰を避けます。NSを2、DSを16、D1を4秒、SW2を20ppmに、TD2を8kに、TD1を周波数リストの長さに設定します。SPNAM10をSqua100、000に設定し、P10を5秒に設定してください。

100ヘルツの照射を生むSP10の出力を見つけてください。照射パルスのSP10の出力を適切に調整してください。適切なコマンドで擬似二次元実験を実行し、SP10照射出力を変える疑似2D実験を一連のセットアップします。

すべてのパラメータを調整した後、NMRスペクトルを読み取るコードを実行し、水信号を積分して新しい変数に保存します。コード反転回復では、適切なデータへの経路を調整し、水の積分領域を確認します。次に、反転回復データを含む実験番号を調整します。

すべての実験パラメータを設定し、アガロースデータセットを同様にフィッティングして得られた空プール値を入力します。凝縮された空コードの最初のセクションを実行し、水の縦方向緩和の適合を求めます。次に、凝縮空フィッティングセクションを実行し、フィッティング関数の最小化を示すライブ図形を開始します。

次のコードセクションを実行して不確実性を特定し、データをプロットします。REDIFINEフィットは、希薄相および凝縮相における拡散係数、凝縮相におけるタンパク質の集団、平均液滴サイズ、およびFUS N末端ドメインサンプルの間期透過率を決定しました。FUS N末端ドメインのNMR信号は凝縮相でも検出可能でした。

相性試料によるアガロース基準とFUS N末端ドメイン間で磁化移動プロファイルに違いは観察されませんでした。CAGリピュートRNA凝縮体では、NMRシグナルは観測されません。したがって、磁化移動プロファイルはアガロース基準とは大きく異なります。

CONDENSE-MT実験は、繰り返し拡大RNA凝縮体の動的特性解析を提供しました。CONDENSE-MT解析により、凝縮水とバルク水間の陽子交換速度論が得られました。CONDENSE-MT解析により、凝縮水中のRNAの横方向緩和時間とバルク水の見かけの横方向緩和率も得られました。

このプロトコルでは、化学タグを不要に二相状態で凝縮液の特性を特徴付けることができます。液滴は希薄な環境と共存し、細胞環境を模倣して二相間の交換を可能にします。凝縮液特性評価に焦点を当てた手法は、従来のNMR法と組み合わせて、相を超えた分子構造相互作用や動力学の研究が可能です。

今後の研究では、より複雑な凝縮液モデルを開発し、その手法をより複雑なシステムに適応させ、最終的には凝縮液を細胞内環境で直接研究することを目指します。