24ウェルラックを用いた中スループットカラムDNA抽出
2026年7月24日
このプロトコルは、プラスミドDNA抽出を加速するための費用対効果の高い方法を説明しています。標準的なスイングバケットプレートローターに対応したカスタム3Dプリントラックを使用することで、研究者は最大48本のキャップ付きスピンカラム、または最大116本のスピンカラムを同時に処理でき、手動のマイクロ遠心分離機法と比べて取り扱い時間を大幅に短縮できます。
本研究では、手動法と自動法の橋渡しとなる、並列スピンカラム方式のDNAおよびRNA抽出用3Dプリントラックに焦点を当てています。本装置は、最大116個のDNAまたはRNAサンプルを同時に処理することを可能にし、多大な労力を要する手動スピンカラム法の限界を解消します。まず、0.4 millimeterのノズルを備えた熱溶解積層方式（FFF）3Dプリンターを使用して、ラックをプリントしてください。
汎用ポリラクチド（PLA）、ポリエチレンテレフタレートグリコール（PETG）、またはアクリロニトリルブタジエンスチレン（ABS）フィラメントを、インフィル100%で使用します。レイヤー高を0.1 millimeterに設定し、サーフェススムージングを有効にします。水密性と機械的安定性が確保されるよう、プリント設定を調整してください。
ラックを初めて使用する前に、防水性のテストを行ってください。使用前に、プリントされたリザーバーに70%ethanolを満たしてテストします。遠心分離の時間を段階的に長くし、漏れや構造的な損傷がないことを確認してください。
接着剤を用いてテストに成功した後、ベースリザーバーの構成部品を接合して密閉ユニットを形成します。適切な抗生物質を含む3〜5 mLのリソジェニーブロス（LB培地）に、escherichia coli（大腸菌）またはE.Coli形質転換体を接種します。培養液を37 °Cで、振盪しながら12〜16時間インキュベートします。
2000 Gで10分間遠心分離して細胞を回収します。上清を捨てます。ペレットに250 microlitersの再懸濁バッファーを加えます。
ボルテックスまたはピペッティングにより、ペレットを完全に再懸濁させます。溶解バッファーを250 microliters加えます。その後、チューブを4〜6回反転させるか、24ウェルプレートをロッキングして、穏やかに混合します。
中和緩衝液を350 µL加え、混合します。白色沈殿の形成を確認し、中和が成功したことを検証します。二酸化チタン粉末を含むチューブに溶解緩衝液を加えます。
体積対質量の比率を2:1にして加えます。二酸化チタン懸濁液250 µLをライセートに添加します。そして、チューブを振って混合します。
中和緩衝液を 350 µL 加え、十分に混合する。2000 G で 10 分間遠心分離を行う。二酸化チタンの存在下で細胞ペレットが完全に沈殿し、上澄みが完全に透明になっていることを確認する。
二酸化チタンが存在しない場合、上清に残留沈殿物があることに注意してください。沈殿物を乱さないように上清を回収し、結合カラムに移します。DNA結合カラムをラックのカラムホルダー層に設置します。
遠心分離中に固定されるよう、カラム蓋を指定のスロットに配置します。清澄化カラムまたはフィルターカラムを、結合カラムの直上にあるフィルターカラム層に配置します。調製した中和済みライセートをろ過カラムに転移します。
組み立てたラックをスイングバケットプレートローターに設置します。室温にて 2000 G で1分間遠心分離します。遠心分離機からラックを取り出した後、フィルターカラム層を取り除いて廃棄します。
リザーバーから流出した液を廃棄容器に捨てます。バインディングカラムを用いてラックを再組み立てします。各バインディングカラムに500から700 µLの洗浄バッファーを加えます。
2000 Gで1分間遠心分離します。リザーバーからのフロースルーを廃棄し、前述した洗浄工程を繰り返します。ラックから結合カラムを取り出し、2 mL回収チューブに移します。
10,000 G以上で1分間遠心分離し、メンブレンを乾燥させます。カラムを清潔な1.5 milliliterチューブに移します。50 microlitersの溶出バッファーまたは水をメンブレンに直接加え、室温で1分間インキュベートします。
10,000 G以上で1分間遠心分離し、DNAを溶出させます。総プラスミド収量は、従来法とラック構成を用いた抽出法の間で有意な差は見られませんでした。プラスミドの確認においては、リラックス型、直線状、および超らせん型の分布が同様であり、保持されていることが示されました。
色素の分布は充填カラム直下の廃棄エリアに限定されており、隣接するウェルや隣接するカラムチップに目に見えるシグナルは検出されませんでした。これは、ラックの設計によって飛散やカラム間の移行の可能性が低減されていることを示しています。増幅は、アンプリコンを添加したカラムからの溶出液においてのみ検出されました。このパーティクルにより、研究者はクローニング、シーケンシング、PCR解析などのダウンストリームアプリケーションに使用可能な高品質なプラスミドDNAを得ることができます。
このプロトコルを実施する際の最も重要な考慮事項は、水密性が高く、オーバーフローのない3Dプリント製リザーバーを維持し、クロスコンタミネーションを防止することです。さらに、本手順に従って作製したこれらのラックは、あらゆるカラムベースの核酸抽出分析に使用可能です。
概要
本記事では、シリカメンブレン・スピンカラムを用いた、ハイスループットDNA抽出のためのセミオートメーション化された拡張可能な手法を紹介します。標準的な遠心プレートローターに対応したカスタム3Dプリント製ラックを活用することで、大量のサンプルバッチを効率的に並行処理することが可能となり、高価な自動液体分注システムに代わる費用対効果の高い代替手法を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 分子生物学
- ゲノミクス
- ラボオートメーション
背景
- シリカメンブランスピンカラム抽出は、高品質なDNA精製に広く用いられています。
- 手動での処理は労力がかかり、大量のサンプルに対するスケールアップが困難です。
- 自動液体操作ロボットは、小規模な研究室にとって非常に高価であることが多いです。
- DNA抽出のための、低コストで拡張可能なソリューションが求められています。
研究の目的
- 効率的な半自動DNA抽出ワークフローを開発すること。
- 標準的な研究室設備を用いてハイスループット処理を可能にする3Dプリント製ラックを設計すること。
- 手動のミニプレップと高価な自動化装置との間のギャップを埋めること。
使用した手法
- スピンカラム用にカスタム設計された3Dプリント製ラック。
- 最大116本の市販スピンカラムを並列処理可能。
- 1回の遠心操作で溶出液の清澄化とDNA結合を同時に行うネスティング構成。
- 洗浄工程と廃棄物管理を簡素化する共通廃棄リザーバー。
主な結果
- DNAの収量および純度は、標準的な手動プロトコルと同等である。
- 24サンプルを超えるバッチでは、総処理時間が50–70%短縮される。
- バッチサイズに関わらず、ろ過、洗浄、および廃棄物処理の処理時間が5–10分短縮される。
- 本システムはオープンソースであり、中小規模の研究室にとって費用対効果が高い。
結論
- この半自動システムにより、DNA抽出のスループットと効率が大幅に向上します。
- 多くの研究室にとって、完全自動化に代わる実用的で手頃な選択肢となります。
- このアプローチにより、ハイスループットなDNA精製技術へのアクセスが民主化されます。
よくある質問
産業界への実用的意義
効率的でスケールアップ可能なDNA抽出は、ゲノミクス主導の創薬およびスクリーニングワークフローにおける重大なボトルネックとなっています。この半自動の中スループットシステムは、完全自動化に比べてわずかなコストと労力で高品質な核酸精製を可能にし、多額の設備投資を行うことなくサンプルスループットの拡大を目指すバイオファーマのR&Dチームを直接的に支援します。このアプローチは、手動のミニプレップと高価なロボティクスとの間のギャップを埋め、創薬パイプライン全体における運用の柔軟性とリソース配分を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 遺伝的スクリーニングおよび標的同定研究を支援するための、迅速かつ並列的なDNA抽出を可能にします。
- 経路解析およびメカニズム研究のためのハイスループットなサンプル処理を容易にします。
- サンプルの整合性を向上させ、ダウンストリームの分子アッセイにおけるばらつきを低減します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイ開発、ジェノタイピング、および分子スクリーニングプラットフォーム向けに、高品質なDNAを調製します。
- 手動操作の手順を最小限に抑えることで、標準化と再現性を向上させます。
- バッチ処理効率を向上させ、化合物または遺伝子ライブラリーの堅牢なスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- バイオマーカーの探索およびバリデーション研究において、信頼性の高いDNA抽出を可能にします。
- 一貫した核酸品質を必要とするトランスレーショナルリサーチにおいて、サンプルの完全性を維持します。
- より大規模なサンプルセットに対応することで、初期探索から前臨床バリデーションまでの継続性を確保します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この半自動抽出システムは、初期のディスカバリー段階と前臨床ワークフローの間に位置し、仮説駆動型研究からハイスループットスクリーニングおよびトランスレーショナルリサーチへのシームレスな移行を可能にします。
- 探索生物学：多様なサンプルセットから効率的なDNA抽出を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイ解析を支援します。
- スクリーニング：ダウンストリームの分子アッセイやスクリーニングプラットフォームに適した、再現性のある定量的なDNA収量を提供します。
- 分析：比較分析および実験条件の統計的評価のために、一貫した核酸インプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：スケーラブルで高品質なDNA調製を必要とするバイオマーカー研究や前臨床研究に適応します。
- 企業内での再利用：複数のR&Dプログラムにわたって繰り返し利用可能な、オープンソースで適応性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：DNAの品質と実験間の整合性を確保することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：大量バッチにおける手作業と処理時間を50–70%削減し、ラボの効率を向上させます。
- 戦略的価値：多額の設備投資を行うことなく、ゲノミクスワークフローの費用対効果の高いスケーリングを可能にします。
- ポートフォリオへの影響：複数のプロジェクトに対して、より高スループットで再現性のあるサンプル処理を可能にすることで、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- 基本的な分子生物学の専門知識およびスピンカラムプロトコルへの習熟が必要です。
- 標準的な遠心機プレートローターおよび3Dプリント製ラックコンポーネントへのアクセスが必要です。
- 操作の整合性とデータ品質を維持するため、チーム間での標準化が求められます。
- 遠心機の容量制限の範囲内で、さまざまなサンプルタイプやスループットのニーズに適応可能です。
- オープンソースハードウェアの入手可能性および現地の作製能力に依存します。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of 3D-Printed Equipment
1:34
Preparation of Bacterial Culture and Cell Lysate
2:43
Preparation of Lysate Using Titanium Dioxide Co-Precipitation
3:41
Assembly of the Filtration Unit for Lysate Clearance and DNA Binding
4:27
Washing and Elution of DNA
5:32
Results
6:22
Conclusion
