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	<li>Roth, T. L., Puig-Saus, C., Yu, R., Shifrut, E., Carnevale, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting.">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 285-297 (2018).</li><li>Li, L. H., McCarthy, P., Hui, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+electrotransfection+of+human+primary+hematopoietic+stem+cells.">High-efficiency electrotransfection of human primary hematopoietic stem cells.</a> FASEB J. 15 (1), 159-167 (2001).</li><li>Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T. M., Herbst, R. H., Dixit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+screen+in+primary+immune+cells+to+dissect+regulatory+networks.">A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks.</a> Cell. 162 (3), 675-686 (2015).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Pollack, M. G., Fair, R. B., Shenderov, A. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrowetting-based+actuation+of+liquid+droplets+for+microfluidic+applications.">Electrowetting-based actuation of liquid droplets for microfluidic applications.</a> Appl Phys Lett. 77 (11), 1725-1726 (2000).</li><li>Sinha, H., Quach, A. B. V., Vo, P. Q. N., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+gene-editing+platform+for+deciphering+cancer+genes.">An automated microfluidic gene-editing platform for deciphering cancer genes.</a> Lab Chip. 18 (21), 3291-3301 (2018).</li><li>Little, S. R., Rizzetto, S., Sherwood, C. A., Quach, A. B. V., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tri-droplet+liquid+structure+for+highly+efficient+intracellular+delivery+in+primary+mammalian+cells+using+digital+microfluidics.">A tri-droplet liquid structure for highly efficient intracellular delivery in primary mammalian cells using digital microfluidics.</a> Adv Mater Technol. 8 (11), 2300719 (2023).</li><li>Little, S. R., Vo, P. Q. N., Sinha, H., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+platform+for+the+microscale+production+of+functional+immune+cell+therapies.">A digital microfluidic platform for the microscale production of functional immune cell therapies.</a> Anal Chem. 97 (21), 11026-11034 (2025).</li><li>Patel, M. A., Boribong, B. P., Sinha, H., Xiao, B., Xie, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+scalable+arrayed+CRISPR+screening+in+primary+cells+enables+discovery+at+the+single+donor+resolution.">Miniaturized scalable arrayed CRISPR screening in primary cells enables discovery at the single donor resolution.</a> Sci Rep. 15, 29350 (2025).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nguyen, D. N., Roth, T. L., Li, P. J., Chen, P. A., Apathy, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency.">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette</td><td>Integra</td><td>4732</td><td>機器類</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>フローバッファ&nbsp;</td></tr><tr><td>96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface</td><td>Thermo Fisher</td><td>174927</td><td>スフェロイドプロトコル</td></tr><tr><td>96-well conical-bottom plate&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td>スフェロイドプロトコル</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>357421</td><td>1 in 200, Clone A161A1</td></tr><tr><td>Attune Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>機器類</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>10564011</td><td>培地サプリメント- スフェロイド培養</td></tr><tr><td>DMF compatible buffer</td><td>DropGenie</td><td></td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>DropGenie Transfection System</td><td>DropGenie</td><td></td><td>機器類</td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Acoustic Dispenser 650 Series</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Qualified 384-well Low Dead Volume</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>フローバッファ</td></tr><tr><td>EGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7201</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescent Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>機器類</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>培地サプリメント- スフェロイド培養</td></tr><tr><td>Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector</td><td>Fida Biosystems ApS</td><td></td><td>機器類</td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510</td><td>Cytek Biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>スフェロイドプロトコル</td></tr><tr><td>Human IL-2 Recombinant Protein,</td><td>Peprotech</td><td>200-02 50ug</td><td>T 細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>Human Primary Pan CD3+ T Cells</td><td>All Cells</td><td></td><td>末梢血、凍結保存済み、pan CD3+ヘルパーT 細胞、ネガティブ選択済み</td></tr><tr><td>Immunocult CD3/CD28 Activator</td><td>StemCell Technologies</td><td>10970</td><td>T 細胞活性化培地</td></tr><tr><td>Immunocult Expansion Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td>T 細胞活性化培地</td></tr><tr><td>Incucyte Live Cell Analysis System</td><td>Sartorius</td><td></td><td>機器類</td></tr><tr><td>INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot</td><td>Integra</td><td>4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),&nbsp;</td><td>機器類</td></tr><tr><td>non targeting synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-202</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human TCR &alpha;/&beta; Recombinant Antibody</td><td>Biolegend</td><td>380805</td><td>1 in 200, Clone QA20B12&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Anti-Human CD8</td><td>BD Pharmingen</td><td>557750</td><td>1 in 200, Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>培地サプリメント- スフェロイド培養</td></tr><tr><td>Poly-L-glutamic Acid (PGA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4761-100MG</td><td>100mg/mlで使用</td></tr><tr><td>Prism version 8.0.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease</td><td>IDT</td><td>10017687</td><td></td></tr><tr><td>Spheroid Microplate</td><td>Corning</td><td>3830</td><td>スフェロイドプロトコル</td></tr><tr><td>Surfactant F</td><td>DropGenie</td><td></td><td>トランスフェクション- DMF 互換バッファ1:20で使用し、完全なトランスフェクションバッファを作る</td></tr><tr><td>TRAC synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>スフェロイドプロトコル</td></tr></tbody></table>

懸濁t細胞および3d細胞モデルにおける低入力crisprゲノム編集およびmrnaトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

A Digital Microfluidic Electroporation Platform for Low-Input CRISPR Genome Editing and mRNA Transfection In Suspension T Cells and 3D Cell Models

懸濁T細胞および3D細胞モデルにおける低入力CRISPRゲノム編集およびmRNAトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

Digital microfluidic (DMF) electroporation enables precise, low-volume genetic manipulation of mammalian cells while minimizing cellular input by up to ...

Our research develops automated digital microfluidic platforms for efficient low input transfection and CRISPR gene editing. Standard electrocuration requires millions of cells. This platform achieves efficient editing with only 10, 000 cells per condition.To begin, obtain a T75 flask from the incubator containing CD3 positive human primary T cells. In the tissue culture hood, transfer the cells to a 15 milliliter falcon tube and centrifuge at a relative centrifugal force of 200 for five minutes. Discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of fresh medium.Pipette 10 microliters of cell suspension into a counter cell counting chamber. Using an automated cell counter, determine the cell concentration and viability. Pipette 100, 000 cells into four to five wells of a V-bottom well plate and place on ice.Reconstitute one lyophilized track knockout targeting single guide RNA or other sgRNA and one lyophilized non-targeting control, or NTC sgRNA, in nucleus free water to a stock concentration of 100 micromolar. After preparing a 100 milligram per milliliter stock solution of polyL-glutamic acid, or PGA, in nucleus free water in two tubes, label the tubes as, tra

a-digital-microfluidic-electroporation-platform-for-low-input-crispr

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、CRISPR-Cas9技術を用いてヒトT細胞の遺伝子編集を行うアッセイを実演しています。初代CD4+およびCD8+...

T細胞の遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9技術

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。...

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。...

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

次世代のエレクトロポレーションは、ヒトTh17細胞に小さなRNAをトランスフェクションし、遺伝子発現と細胞の挙動を変化させる効率的な方法です。...

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ここに提示される、チューブエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞における効率的なCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介遺伝子編集のためのプロトコルである。...

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26...

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

このプロトコルでは、ラボオンチップのマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスを構築するために必要な微細加工技術について説明します。実験セットアップは、制御された単一細胞レベルのトランスフェクションを連続フローで実行し、集団ベースの制御により、より高いスループットに拡張することができます。細胞膜透過の程度をリアルタイムで電気的に監視する機能を示す分析が提供されます。...

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

このプロトコールは、プラスミドDNAトランスフェクションおよびmRNAヌクレオフェクションを使用したヒト細胞株におけるClustered Regularly Interspaced Short Palindromic...

プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションデリバリーを用いたヒト細胞におけるCRISPRエピゲノム編集

このプロトコルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット分析のために、3次元組織模倣内のトランスフェクトされた細胞の空間分布を使用して、計算モデリングを使用して可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化します。...

エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

RNAとしてゲノム編集者を送達することは、一次哺乳類の細胞や細胞株のゲノム改変において特に強力な手段です。このプロトコルの目的は、ゲノム編集者をmRNAとして一次哺乳類の細胞および細胞株に届け、その後、Illuminaの標的シーケンスと解析を行って編集結果を定量化することです。...

一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

DropGenie.  このプロトコルは、一次ヒトT細胞におけるTCRα/β受容体の微型CRISPR–Cas9ゲノム編集を、デジタルマイクロ流体(DMF)エレクトロポレーションプラットフォーム「DMF-ection」を用いて説明しています。この方法は並列で低入力の遺伝子編集を高生存率で可能にし、さらにmRNAの多細胞3D球体への送達にも適応可能です。

懸濁T細胞および3D細胞モデルにおける低入力CRISPRゲノム編集およびmRNAトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

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