脂肪間隙血管分数における反射光を用いた老化検出

脂肪細胞の老化を肥満や高インスリン血症などの異なる脂肪堆積や代謝状態にわたり研究しています。従来のブライトフィールドベースのSABGアッセイは多重化をほとんど許さず、非常に主観的です。新しいプロトコルは主観的でなく、多重化も可能です。

まず、人間の脂肪組織が入ったチューブを回収します。10グラムの脂肪組織を均質化し、0.05%のタイプ1コラーゲン酵素を含むチューブに加えると、約100万個の間質血管分画(SVF)細胞が得られます。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに50万個の細胞をアリコートに入れます。

細胞固定のために2%パラホルムアルデヒドを1ミリリットル追加します。その後、室温のロッカーで20分間孵化します。600Gで遠心分離機で10分間かけて上澄液を取り除きます。

メーカーの指示に従って、老化ベータガラクトシダーゼ染色キットを使用してX-Gal染色液を準備してください。染色液を1ミリリットル、新しい3本のチューブに入れます。そして、塩酸1モルまたは水酸化ナトリウム1モル溶液でpHを5、6、8に調整します。

校正済みのpHメーターを使ってpHを確認してください。50万個のセルを含む各ラベルチューブにpH調整済みのX-Gal染色液を加えます。24時間、27度の温度で二酸化炭素なしで孵化します。

セルを600Gで10分間遠心分離します。上清液を除去した後、細胞をPBSで洗浄します。そして600Gで10分間遠心分離機にします。

上清液を除去した後、異質なSVF内の内皮細胞を特定するために、細胞内皮特異的CD31で細胞を培養するか、IgG一次抗体を4度Cで一晩培養します。細胞を0.1%PBSTで3回、室温のロッカーで10分間洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。そして600Gで10分間遠心分離機にします。

上清液を捨てた後、細胞を室温のロッカーで1時間培養します。600Gで遠心分離機で10分間、二次抗体染色液を除去します。先ほど示したように、PBSTでセルを3回洗浄し、遠心分離機で行います。

アンチフェードマウントにセルを再懸浮させてください。細胞懸濁液を顕微鏡スライドにピペットで固定し、室温で一晩硬化させて細胞を固定します。翌日、100%グリセロールを100マイクロリットル追加します。

カバースリップをその上に敷き、ネイルポリッシュで密閉します。準備済みのスライドを共焦点顕微鏡のステージに置きます。顕微鏡ソフトウェアのインターフェースで光経路オプションを選択し、ビームスプリッターの設定をT90R10に調整します。

次に、ミラー設定で二次二色性ミラー(SDM)のカットオフ波長値を検証します。検出器メニューで「染色料と検出器選択」オプションをクリックして、チャネルと励起波長を割り当てます。次に、各レーザーのレーザー出力強度パーセンテージ値を10%から15%の範囲で設定します。シリーズメニューのLSMセクションでZオプションをオンに切り替えます。Zステップサイズをシステム最適の0.74マイクロメートルに設定します。

次に、Zセクションメニューで開始入力フィールドの値を入力し、膜信号に基づいてZスタックを定義して細胞体積全体をキャプチャします。取得パネルのLSM入力欄にファイル名とセーブ場所を入力します。そして「LSM Start」をクリックして画像取得を開始してください。

そしてファイルをOIRネイティブ顕微鏡形式で保存してください。取得後は、Zナビゲーションの矢印を使って、Zスタック全体にわたる異なる染料の信号と焦点分布を確認します。保存したoirファイルを画像 J.In バイオフォーマットインポートオプションのポップアップウィンドウにアップロードし、「OK」をクリックします。

画像メニューをクリックしてファイルを開いてください。ドロップダウンから「カラー」を選択し、「チャンネル分割」オプションで、異なるチャンネルを別々のウィンドウとして開きます。次に、画像メニューの調整オプションを使って明るさのコントラストを調整し、LUT値を最適化して画像の可視化を強化します。

フレーム下部のZ軸スクロールバーを使って光学セクションを移動し、スタック全体のセルラー機能を確認します。画像メニューの中から「スタック」を選択してください。次に、Zプロジェクト関数を選択して三次元共焦点画像の合計強度投影を生成します。

Z投影ダイアログボックスで、開始と終了のスライス範囲を定義します。投影タイプを選択し、「OKAY」をクリックすると最終的な2D合成画像が得られます。次に、画像メニューに移動します。

画像タイプを16ビットに調整するには「タイプ」オプションを選択してください。その後、画像を保存して16ビットのTIFファイルとしてエクスポートします。保存した画像をCellProfilerバージョン4.2.8にインポートすると、自動セルセグメンテーション、各セルの反射光強度の定量化、強度測定値をスプレッドシートにエクスポートできます。

スプレッドシートで、老化関連ベータガラクトシダーゼ陽性の閾値を、pH8条件の平均反射光強度と3つの標準偏差の合計として定義します。pH6の細胞は、強度値が確立された閾値を超える場合、老化関連ベータガラクトシダーゼ陽性と分類します。ヒトSVF細胞の反射光老化関連ベータガラクトシダーゼ染色は、3つのpHレベルにわたって明確かつ再現可能なパターンを生み出しました。

pH5では、多くの細胞が高い内因性酵素活性のために強いシグナルを示しました。pH6のアッセイ標準値では信号強度と頻度が低下し、老化関連のベータガラクトシダーゼ細胞の特異的同定が可能となりました。pH8では信号は最小限であり、これが陽性の閾値を定義する基準となりました。

検出感度試験では、反射光イメージングがすべてのpH条件下でブライトフィールドを上回ることが示されました。pH5では反射光で強いX-Gal沈殿が見られましたが、ブライトフィールドは最大の堆積物のみを捉えました。pH6では反射光により、ブライトフィールドでは弱すぎるか拡散している陽性細胞が識別されました。

pH8では反射光イメージングで最小限の信号を検出し、低酵素活性と一致し、中間および低活性レベルのX-Gal沈殿物の同定においてBrightfieldを上回りました。この反射光イメージングのワークフローは、pH依存の老化関連ベータガラクトシダーゼおよびCD31などの蛍光系マーカーの同時検出を統合し、異質なSVF集団内で単一細胞分解能で多機能老化評価を可能にしています。このプロトコルにより、感度が高く定量的なSABG活性測定が可能であり、同時に他の老化マーカーだけでなく、他の細胞マーカーも測定可能です。

主な課題は、初期の顕微鏡のセットアップだと思います。しかし最適化が完了すれば、同じ取得パラメータを実験間で使うことができます。今後の研究では、このアッセイを他の細胞内マーカーと組み合わせて、SABGが異なる細胞プロセスとどのように関連しているかを調べることができます。