ツメガエル初期胚発生における新生転写体の代謝標識

本研究では、ツメガエルの初期胚発生における接合遺伝子の活性化と遷移的調節がどのように起こるかを調査します。既存の手法では、新たに活性化された接合体転写体が豊富な母体RNAを放出しているかどうかの検出に苦労しています。このプロトコルは、未熟な転写本に標識を付け、強化します。

まず、マイクロインジェクションチャンバーをステレオ顕微鏡の下に置き、1ミリリットルのフィコル溶液をチャンバーに加えます。0.1倍のマークで保存されたアフリカツメガエルの胚を入手してください。修正されたリンガーやMMR溶液です。プラスチックのトランスファーピペットを使い、20個以上の胚をマイクロインジェクションチャンバーの中心に移植します。

注射針は、細い針の先端をピンセットで切り取って準備します。針を垂直に位置し、先端を下に向けて、マイクロローダーチップ付きのP2ピペットで50 mM 5-エチニルルジンまたは5 M EUを0.5マイクロリットル装填します。針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。

P10ピペットを使い、ステレオ顕微鏡の下に設置されたステージマイクロメーターに10マイクロリットルのハロカーボンオイルを置きます。体積校正のために、マイクロインジェクターのフットペダルを踏み、マイクロメーターのハロカーボンオイルに一滴を注入します。マイクロインジェクターの圧力と注入時間を、液滴径が0.27ミリメートルになるまで調整します。

ピンセットで1細胞期の胚を保持し、マイクロマニピュレーターで針を操作して50 mM 5 EUを10ナノリットル注入します。注入された胚を新しいガラス皿に移し、フィコル溶液を含んで1時間インキュベートします。Ficoll溶液を除去し、0.1 XMMR溶液を加えます。発生中の胚を目視で確認し、必要に応じて異常胚を取り除いてください。

希望の発生段階にある10個の胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移植します。チューブから残留培地を取り除き、胚を液体窒素でスナップ冷凍し、マイナス80度の冷凍庫で保存します。その後、胚から総RNAを抽出し、市販キットでその濃度を測定します。

50マイクロリットルのクリック反応を行うには、示された成分を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブで混合します。反応ミックスを室温のヌテーターで30分間培養します。次に、各反応混合物にグリコーゲン、酢酸アンモニウム、冷却エタノールを加えます。

ピペットで5回よく混ぜます。マイナス80度の冷凍庫で一晩孵化させます。一晩の培養後、13,000Gで4度Cで20分間遠心分離機をかけ、ペレットを乱さずに上澄液を除去します。

700マイクロリットルの75%エタノールでペレットを2回洗います。遠心分離して上清液を廃棄した後、ペレットを室温で5〜10分間自然乾燥させ、その後10マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁させます。ストレプタビジンコーティングされた磁気ビーズ5マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに注入します。

ビーズにウォッシュバッファー2を9マイクロリットル加え、よく混ぜます。チューブを磁気ラックに2分間置きます。上澄液を取り除き、洗いをさらに2回繰り返します。

その後、5マイクロリットルのウォッシュバッファー2にビーズを再懸浮させます。1.5マイクロリットルのマイクロ遠心分離機チューブでマスターミックスを準備します。RNAサンプルを含む各チューブにマスターミックスを15マイクロリットル追加します。

チューブをヒートブロックに置き、69度Cで5分間孵化します。その後、チューブを氷に冷やしてください。次に、各RNAサンプルに5マイクロリットルの洗浄済みビーズを加え、室温のヌテーターで30分間培養します。

ビーズRNA複合体を50マイクロリットルのウォッシュバッファー1で5回洗浄し、その後50マイクロリットルのウォッシュバッファー2で5回洗浄します。ビーズを5マイクロリットルに再懸浮させ、洗浄バッファー2を充填します。新生EU RNAを含むビーズを直接使用し、補完的なデオキシリボ核酸合成とライブラリーの調製を行います。

受精後6時間の新生転写体と受精後5時間のものを比較した際、受精ゲノム活性化時に差異活性化遺伝子の数が増加し、受精7時間後、受精後8時間、受精後9時間でさらに増加が観察されました。接合遺伝子は、EUのRNAシーケンシングデータにおいて、より高レベルで、かつ初期段階で検出され、全RNAシーケンシングデータと比較して見られました。代謝標識された新生RNAの慎重な精製が、このプロトコルにおける感度と特異性を確保する最も重要な要素です。

このプロトコルで生成されたEU標識新生RNAは、in vitroでさらに生化学的に解析可能です。このアプローチにより、将来の研究でゲノム活性化パターン、組織特異的な遺伝子発現、調節機構を単一細胞分解として調査できるようになります。