低栄養素および変動する栄養条件下での 大腸菌 研究のための連続培養ミリ流体装置

私の研究は、細菌が自然環境に典型的な低く変動する栄養条件に生理学的にどのように適応するかを調査することに焦点を当てています。従来の栽培システムは低動的栄養条件の再現が不十分ですが、私たちのシステムはこれらの環境関連条件での栽培を可能にします。実験の前日に一晩培養を準備してください。

前培養液を、6ミリリットルのフルリッチ定義培地(RDM)入ったチューブに6マイクロリットルの一晩培養液を加えて前培養を準備します。混合物を15ミリリットルの培養チューブを2本に均等に分け、AとBとラベル付けします。両方のチューブを37度の温度で培養し、振る速度は200 RPMで行います。600ナノメートルの光密度をチューブBで監視し、光学密度が約0.5に達するまで進行しないでください。

孵化中は低RDM培地を準備し、異なる時間点にボトルごとに総体積を割り当てます。その後、3本のチューブが付いたキャップで各ボトルを密封します。3番目に幅のシリコーンチューブを0.2マイクロメートルのベントフィルターに接続し、無菌空気交換を行います。

各ペリスタルティックチューブの一端を、オスのルアーロックコネクターを装着して、小径のシリコーンチューブに取り付けます。実験が始まるまで、蠕動剤チューブの反対側にある自由なオスのルアーロック継手にアルミホイルのカバーをそのままにしておき、汚染防止のため実験が始まります。哺乳瓶と蠕動剤ポンプを37度に設定したインキュベーターに入れます。

すべての蠕動チューブを同じポンプヘッドのチャネルに固定し、すべてのフィルターで同じ流量を確保します。5.4ミリリットルの低RDMを入ったチューブに600マイクロリットルの培養液を加え、前培養液を1対10の比率で希釈します。1ミリリットルのピペットを使い、6つの0.45マイクロメートルのポリビニリデンフッ化物(PVDF)フィルターそれぞれに希釈した培養液を1ミリリットル注入します。

一方通行逆止弁をオートクレーブした超純水で洗い流した後、フィルターの両端に取り付けます。チューブの継手からアルミホイルカバーを外してください。各フィルターを蠕動性チューブの継手に接続してください。

蠕動ポンプの流量を毎分2ミリリットルに設定してください。フィルターの下に排水口を設置して排出水を集め、流れを始めます。2時間後、1リットルボトルに接続されたフィルターの1つを抜き、一方通行逆止弁を外し、フィルターを50ミリリットルの遠心分離機管に入れ、入口を下に向けて設置します。

遠心分離機は2,000Gで2分間。滅菌済みのパイプカッターを使って、プラスチックケースの出口端に優しく圧力をかけてフィルターを開けます。内側の円筒を解放し、膜を含む部分を廃棄します。

採取した培地でフィルターケースの内壁をすすいでください。5ミリリットルの血清学ピペットを用いて総体積を測定します。サンプルから100マイクロリットルのアリコートを3つ取り、グルターアルデヒドで最終濃度1.5%に固定します。その後の時点で対応するフィルターのプラグを抜き、採取手順を繰り返します。

採取したサンプルにはそれぞれの時間点にラベルを付けてください。蛍光DNA染料で標識を付け、フローサイトメトリーで細胞数を計ります。時間の経過とともに、log 10の変換セル数は線形軌道をたどり、すべての条件下で指数関数的成長を示しました。

成長率は、0.5%RDM条件で約0.88/時間、0.25%条件で0.64/時間、0.01%条件で0.18/時間でした。細胞数はサンプルあたり最大10億個に達し、ミリフルイド型連続培養装置(MCCD)がナノモルからマイクロモルの栄養素濃度で指数関数的成長と高いバイオマス収量の両方を支えることが示されました。0.5%RDMで培養された細胞は、0.01%RDMで培養した細胞よりも平均細胞長が長かった。

低栄養素栽培における主な課題は、詰まりや圧力の蓄積、栄養素の枯渇を防ぐために十分な細胞密度を維持することです。この手順の後、細胞はプロテオミクス、メタボロミクス、その他のオミクス手法などの下流解析のために採取されます。今後の研究では、このプロトコルと定量的オミクス解析を統合することで、栄養制限や変動に対する微生物の適応を調査することができます。