ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング
2026年7月17日
本記事では、IMR-90ヒト線維芽細胞における老化期のリソソーム再構築を測定するための生細胞LysoTrackerプロトコルを紹介します。
細胞老化とその特徴付けを研究し、リソソーム変化のような特徴が老化マーカーとしてどのように機能するかに焦点を当てています。従来の老化マーカーはしばしばエンドポイントベースかつ二値的ですが、ライブセルイメージングは老化を連続的な量的シグナルとして読み取ります。まず、IMR-90線維芽細胞を24ウェルプレートにシードし、5%二酸化炭素インキュベーターで37度の環境で培養し、サブコンフルエント単分子層を形成します。
各実験ごとにシーディング密度とプレート塗りとリソソーム染色の間の時間を記録してください。培養培地全体を37度まで温めます。培地に75ナモルのLysoTracker Deep Red作業液を準備し、光から保護します。
作業中の溶液を優しく逆さまに混やします。定義された老化誘導法を用いて調製した相合した前老化型および老化期のIMR-90線維芽細胞コホートを選択。成長特性や形態を監視して老化表現型を確認します。
各井戸から使用済みの培地を吸引します。各井戸の壁に沿ってLysoTrackerの作業液を優しく加え、単一層への影響を防ぎます。細胞をLysoTrackerで37度の環境で30分間、5%二酸化炭素のインキュベーターで培養します。
LysoTrackerの培養最後の10分間に、メーカー推奨の作業濃度でHoechst 33342を直接ウェルに加え、プレートを優しく揺らして混合します。培養終了時に染色培地を取り出し、予備加熱されたPBSで細胞を一度洗浄して背景蛍光を減らします。すすぎ直後、予め温めたフェノールレッドフリーの培地を加えます。
バッファ交換からデータ取得までの時間をすべてのウェルで一貫させ、直接ライブセルイメージングに進みます。培養プレートの平行ウェルにベータガラクトシダーゼ染色用に標識を付け、高齢細胞と事前老化対照群を比較します。固定前の検証ウェルのための完全なライブセルイメージング。
ライブイメージング中にステージ座標を記録し、固定後に同じフィールドを再配置します。2%ホルムアルデヒドと0.2%グルターアルデヒドを含む老化ベータガラクトシダーゼ染色キットの固定液を細胞に加えます。皿に蓋をして室温で10〜15分間孵化させます。
固定剤を除去し、PBSでウェルを2回洗い流します。次に、pH6のX-gal基質を含むベータガラクトシダーゼ染色液を各ウェルに加えます。培養中の蒸発を抑えるためにパラフィルムでプレートを密封し、222度の22ガスなしの37度のドライインキュベーターに12〜16時間置きます。
固定と染色の後、プレートを顕微鏡ステージに置き、記録されたステージ座標を使って同じイメージングフィールドを再配置します。明視野顕微鏡でウェルを検査し、染色パターンを記録します。各状態の代表的な画像を取得し、ウェルごとの老化関連ベータガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を決定します。
沈静細胞は明るく空間的に拡大した核側リソソーム濃縮領域を示し、一方で老化前の対照群は離散的な点状構造で全体のシグナルが低かった。老年期疾患では、老齢前対照群よりもβ-gal陽性細胞の割合が高いことが示されました。複製ウェル全体で、LysoTrackerの濃度と老化関連のβ-gal陽性面積との間に強い相関が観察されました。
陽性マスク内の平均LysoTracker強度は、高齢培養で高く、両条件を間違える最も堅牢なフィールドレベルの識別因子となりました。統合されたLysoTrackerの核あたり強度は、代表的なフィールドの高齢培養でも高く評価されました。このプロトコルにより、研究者は生細胞内のリソソームリモデリングを測定し、老化負荷と進行の定量的な単一細胞の読み取り結果を提供します。
強度比較は1回のセッションでのみ有効であるため、すべてのウェルで染色および画像設定を同一に保つことが重要です。今後の研究では、この手法を三次元モデル、追加の細胞タイプ、異なる顕微鏡システムやワークフローでの検証に拡張できる可能性があります。
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Overview
This article presents a live-cell imaging protocol for assessing cellular senescence by quantifying lysosomal remodeling using LysoTracker Deep Red, an acidotropic fluorescent dye. The method provides an indirect, pH-dependent readout of the acidic organelle compartment, serving as a practical correlate of senescence burden in cultured cells, specifically demonstrated in IMR-90 human lung fibroblasts undergoing replicative senescence.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Cell biology
- Live-cell imaging
Background
- Cellular senescence is characterized by stable cell-cycle arrest and distinct phenotypes, including enlarged morphology and altered secretory profiles.
- Senescent cells show pronounced lysosomal remodeling and expansion of the acidic endo-lysosomal compartment.
- Changes in lysosomal acidity and degradative capacity are hallmarks of senescence.
- Traditional senescence assays include SA-β-Gal staining, but live-cell compatible, quantitative methods are needed.
Purpose of Study
- To provide a simple, live-cell imaging protocol for quantifying lysosomal remodeling as a correlate of senescence.
- To demonstrate the use of LysoTracker Deep Red for assessing acidic organelle expansion in senescent cells.
- To offer a quantitative complement to conventional endpoint assays for senescence.
Methods Used
- Culturing and serial passaging of IMR-90 human lung fibroblasts to induce replicative senescence.
- Staining live cells with LysoTracker Deep Red to label acidic organelles.
- Fluorescence imaging to visualize and quantify lysosomal signal intensity and lyso-positive area per cell.
- Optional SA-β-Gal staining on parallel cultures as a confirmatory marker.
Main Results
- Late-passage, senescent cultures exhibited higher LysoTracker signal and larger lyso-positive regions compared to early-passage controls.
- The observed increase in acidotropic dye signal is consistent with expansion of the acidic organelle compartment during senescence.
- The method provides an indirect, quantitative measure of lysosomal remodeling associated with senescence.
Conclusions
- The protocol offers a simple, adaptable approach for live-cell assessment of senescence-linked lysosomal remodeling.
- Results should be interpreted as indirect correlates of lysosomal changes, not direct measures of lysosome number or biogenesis.
- The method can be extended to other cell types or senescence-inducing conditions.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cellular senescence using LysoTracker-based lysosomal profiling enables early detection of senescence-linked organelle remodeling in human fibroblasts. This live-cell imaging approach provides a scalable, indirect readout of senescence burden, supporting predictive confidence in discovery-stage cell models. Integrating such quantitative, adaptable assays strengthens portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of senescence-associated organelle remodeling as a functional biomarker.
- Supports biological de-risking by quantifying lysosomal changes linked to cell-cycle arrest.
- Facilitates predictive confidence in cell-based models for target validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live-cell systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of lysosomal signal intensity and area per cell.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of senescence in human fibroblasts.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of senescence-modifying interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular remodeling endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This lysosomal profiling protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing and quantitative assessment of senescence in cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of senescence-linked lysosomal remodeling and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in live-cell assays.
- Analytics: Delivers image-based measurements of lysosomal signal intensity and area per cell for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains continuity with disease-relevant fibroblast models and senescence endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable, live-cell assay platform for diverse senescence-inducing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence studies.
- Operational Value: Enables standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, early-stage readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types and senescence-inducing stresses with protocol optimization.
- Interpretation is limited to indirect correlates of lysosomal remodeling, not direct lysosome quantification.
