潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

私たちの研究の焦点は、治療戦略の進展を目的とした新規抗結核薬候補の開発と検証にあります。予防表現型スクリーニングパイプラインは、結核菌株に対する新しい医薬品の探索に活用できます。まず必要な試薬を集め、提示された比率で反応混合物を準備します。

反応混合物を85度Cで16時間かき混ぜます。回転蒸発器を使って溶媒を除去します。残留物に約20ミリリットルの飽和重炭酸ナトリウム溶液を加えます。

この懸濁液は11マイクロメートルのセルロース質性フィルターペーパーで濾過し、残留固形物を収集します。残留固形物をクロロホルム50ミリリットルに溶かします。分離用のじょうごを使ってクロロホルム溶液を15ミリリットルの水で3回洗い流します。

水の層を毎回取り除いています。有機相に無水硫酸ナトリウムを加えて残留水分を除去し乾燥させます。溶媒を蒸発させた後、得られた緑色の固体を約50度の温度で10ミリリットルの熱いヘキサンで4回洗います。

化合物6を1ミリグラムに加え、アセトニトリルとメタノールの1対1混合液を1ミリリットル加えてストック溶液を準備します。分析前にストック溶液を0.5ミリグラム/ミリリットルに希釈しろ過します。サンプルをHPLCシステムに取り込みます。

クロマトグラフィーのデータ取得ソフトウェアを使用してデータを取得・処理してください。クロマトグラフィー法を、粒子サイズ5マイクロメートルの250×4.6ミリメートルの逆位相C18カラムを使用するように設定します。流量を1.5ミリリットル毎分に設定し、紫外線検出を254ナノメートルに設定します。

プログラムされた移動位相組成変化で提示された勾配を設定します。約15〜20ミリグラムの化合物6を核磁気共鳴管またはNMR管に移します。適切な量のDMSOD6に溶かします。

取得パラメータが提示通りに設定されたら、標準パルスシーケンスで陽子NMRスペクトルを取得します。取得パラメータを調整してください。陽子と炭素13のNMRスペクトルを開始し、化学シフトを百万分の一で報告します。

実験から得られた自由誘導崩壊ファイルを使ってNMRデータを可視化し処理します。化合物6のクロマトグラフィーによる精製には、シリカゲルを充填してカラムを充填します。粗い化合物6をカラムに積み込みます。

化合物を洗い出し、分株を集めます。薄層クロマトグラフィーで分画を監視し、純粋な生成物を含む分画を組み合わせます。7H9ブロス100マイクロリットルに10%アルブミンデキストロースカタラーゼ(ADC)を補足して、96ウェルプレートの12列に加えます。

次に、10%ADCと5%DMSOを含む7H9ブロス100マイクロリットルを11柱に移す。そして9列から1列へ順番に進みます。10列に200マイクロリットルの化合物溶液を加え、各化合物に1行ずつ割り当てます。

96ウェルプレートの12柱に、最高テスト濃度の2倍の濃度で化合物溶液100マイクロリットをピペットで送り込みます。10号柱から9号柱に100マイクロリットルを移し、ピペッティングでよく混ぜて2倍の穀物希釈を開始します。連続希釈を連続して続け、列1まで続けます。

結核菌の細菌懸濁液を11列から1列目に順に100マイクロリットル追加し、プレートを覆います。プレートをパラフィルムで密封し、37度で7日間培養します。次に、プレートの各ウェルに0.01%レサズリン溶液60マイクロリットルを加え、蓋をします。

プレートをパラフィルムで密封し、37度で48時間培養します。次に、青からピンクへの色の変化を確認しましょう。血清フリーDMEMで0.5ミリグラム/ミリリットルMTTの作動溶液を準備します。

化合物6で処理したVeroおよびHEPG2細胞を48時間採取し、治療効果を評価するために検査します。培地を板から吸引し、低光条件下で各井戸に50マイクロリットルのMTT作業液を加えます。3時間のインキュベーション後、各ウェルに100マイクロリットルのDMSOを加え、低光条件下でフォルマザンの結晶を溶解させます。

プレートを100回転の軌道シェーカーに15分間置き、光から保護します。制御井戸を点検して結晶の完全な溶解を確認してください。プレートをマイクロプレートリーダーに入れます。

基準波長を630〜690ナノメートルに設定し、570ナノメートルで吸収をチェックします。血清フリーDMEMで40マイクログラム/ミリリットルの中性赤色ワーキング溶液を準備します。次に、1%氷河酢酸、49%エタノール、50%超純水を含む中性赤色脱着溶液を準備します。

化合物6の効果がVeroおよびHEPG2細胞に評価されたら、培地を除去し、各ウェルにろ過済み中性赤色作業液100マイクロリットルを加えます。プレートを37度で2時間、5%の二酸化炭素で孵化させます。中性の赤色作動液を取り除いた後、各井戸を150マイクロリットルの滅菌PBSで一度ずつすすいでください。

各井戸に中性赤色脱着溶液を150マイクロリットル加えます。プレートを150回転/分の軌道シェーカーに15分間置いて染料を抽出します。完全な染料抽出を確認するためにコントロールウェルを確認してください。

マイクロプレートリーダーで540ナノメートルの吸収を読み取ります。HPLCクロマトグラムでは、化合物6の保持時間が14.11分、純度が99%であることが示されました。プロトンNMRスペクトルでは、ピペリジン成分の特徴的なシグナルが1.50〜3.13ppmの間で示されました。2.38ppmのメチルシングレットだ。

また、6.97および7.17ppmのダブルレットや7.63〜7.75ppmの多重項を含む芳香族シグナルも含まれます。炭素13 NMRスペクトルでは、メチル炭素信号は23.81ppm、ピペリジン関連信号は24.85〜49.70ppmでした。MTTプレートは化合物濃度間で明確な色の勾配を示し、細胞毒性は半透明ウェルを持つ高濃度化合物で最も高く、低濃度で深い紫色ウェルで最も低いことが示されました。

中性赤色取り込みプレートは化合物濃度間で明確な色の勾配を示し、細胞毒性は半透明ウェルを持つ高濃度化合物で最も高く、低濃度で深いピンクウェルで最も低いことが示されました。このプロトコルは、表現型スクリーニングに基づく結核に対する薬剤候補の開発パイプラインを示しています。プロトコルを適用する際には、合成化合物の低溶解度を考慮し評価することが重要です。

この研究は、将来のバイオアベイラビリティ、マクロファージ感染、生体内研究の基礎となり得ます。