ユー グリーナ・グラシリス をキャッサバベースの基質に異栄養栽培として適応させる方法

私たちの研究は、新しいユーグレナ・グラシリスの葉をキャッサバ廃棄物に適応させ、成長、シアン化物削減、タンパク質豊富なバイオマス生産の研究に焦点を当てています。このプロトコルは持続可能なキャッサバ加工、農業廃棄物の価値評価、飼料生産、低コストのバイオテクノロジーシステムに適用可能です。まず、無菌の500ミリリットルのベント付きキャップフラスコに基質タイプを「garri」とラベル付けします。

フラスコに適切な目標濃度をマークしてください。フラスコには、複製の識別と計画された滅菌状態を「オートクレーブ」または「非オートクレーブ」とラベル付けしてください。分析天秤に計量船を置く。

タレを押した後、ガリを最終作業量に合わせて計量します。無菌的に計量したガリを、300ミリリットルの脱イオン水または蒸留水を含む滅菌500ミリリットルのフラスコに加えます。各フラスコにベントキャップを再度装着してください。

各懸濁液を3分間混ぜて均質化します。磁気攪拌を使う場合は、フラスコを攪拌板に置き、速度を200Gに設定して浅い渦を作り、水しぶきが出ないようにしてください。25度の温度で10分間、懸濁液を乱さずに保湿させます。

発酵直前にベントキャップを締め、フラスコを手で5回回して混合物を優しく均質化し、沈殿した物質を再び懸浮させます。追加のキャッサバ製品媒体を準備するには、フラスコにラベルを貼り、前述の通り基質を計量し、作業体積に基づいて30グラム/リットルを達成します。無菌的に計量された基質を、300ミリリットルの脱イオン水または蒸留水を入れた滅菌フラスコに加えます。

各フラスコにベントキャップを再度装着してください。先ほど示した通り、サスペンションを水分補給して混同します。フラスコに無菌のガス透過性ベントキャップが装着されており、環境汚染を最小限に抑えつつガス交換を可能にしていることを確認しましょう。

フラスコは直射日光や交通量の多い場所から離れた指定場所で、25度の温度で立てて置き、最低72時間は攪拌せずに孵化させます。各フラスコの発酵開始日と時間と状態を記録してください。発酵後の500ミリリットルのフラスコに最大300ミリリットルの液体が含まれていないことを確認すると、滅菌時の沸騰を防ぎましょう。

ベントキャップが指で締められる程度に緩めたら、フラスコにオートクレーブ用のインジケーターテープを貼ります。フラスコをオートクレーブ安全なトレイに入れた後、トレイをオートクレーブに入れ、P13液体サイクルを選択します。液体滅菌のために滅菌パラメータを121度に設定し、30分間使います。

オートクレーブサイクルを始めてください。サイクル終了後、オートクレーブ室の圧力を大気圧に戻し、ゆっくりと扉を開けます。耐熱性の手袋を使い、フラスコを取り出して室温まで冷ます。

冷却したフラスコは接種前に室温で一晩保管してください。発酵したキャッサバ培地をオートクレーブせずに直接使用し、在来微生物群集を保存します。72時間の発酵後すぐに非高圧滅菌された培地に接種し、意図しない環境汚染を最小限に抑えてください。

同じタイプの500ミリリットルのベントキャップフラスコ、同じ作業量、同じ発酵時間をすべての基質条件で使用し、レプリケート間での取り扱いを一貫させてください。ユーグレナ・グラシリスを新鮮な異種栄養培地に接種してください。培養物は28度摂氏の完全な暗闇で培養し、120Gの軌道振動を継続して培養し、培養物が中間対数成長に達するまで続けます。

複合光学顕微鏡を明視野モードで使い、100倍から400倍の総倍率で培養物を調べ、活発な運動性、細長い細胞形態、低い持続レベルを確認します。過剰な細胞残骸、異常な形態、適応実験前の過剰な要求を示す培養は除外します。ベントキャップを締めてスターター培養を優しく均質化した後、フラスコを手で15秒間回し、細胞の均一な分布を保ち、過度なストレスを誘発しません。

ノイバウアー血液細胞計を使い、細胞密度を測定します。培養液を15秒間回して混合した後、1ミリリットルの培養液を無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離機チューブに移します。ヘモサイトメーターとカバースリップを70%エタノールで洗浄し、ヘモサイトメーターとカバーを自然乾燥させます。

ヘモサイトメーターの2つのグリッドに10マイクロリットルの培養液をピペットで注ぎ、カバースリップを湿ったサンプルに貼ります。10倍対物レンズを持つブライトフィールド顕微鏡を使い、グリッドに焦点を合わせ、標準的な境界ルールを適用して大きなグリッド上の定義された正方形内のセル数をカウントします。2番目のチャンバーで細胞数を繰り返し、ミリリットルあたりの平均細胞数と細胞密度を計算します。

すべての実験培地で最終接種量が体積あたり5%になるよう、接種量を調整します。各処理条件下で別々の接種剤を準備し、実験群間の初期細胞密度を一貫させます。準備済みのE. gracilis接種物を、最終ガリ濃度10、20、30グラム/リットルで調製したオートクレーブおよび非オートクレーブされたキャッサバ培地に加えます。

すべての処理条件下で均等な接種量を用い、初期細胞密度を標準化します。通気したキャップを締めた後、フラスコを円を描くように15秒間優しく回して細胞を分散させます。培養菌を25度の完全な暗闇で培養し、異栄養成長を始めます。

非オートクレーブされた培地の攪拌を最小限に抑え、ネイティブの微生物群集構造と基質の層化を保つこと。すべての培養液を1日1回、E. gracilis細胞と浮遊中のキャッサバ物質との接触を保つために15秒間、優しく手で回して混ぜます。滅菌ピペットの先端を使い、48時間ごとに各培養から1ミリリットルの無菌サンプルを採取します。

サンプリング前にベントキャップを締め、培養フラスコを15秒間優しく回して細胞と懸濁物質の均等な分布を確保します。培養液を無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離機チューブに移した後、必要に応じて脱イオン水でサンプルを希釈し、個々の細胞の可視化を図ります。湿式マウント顕微鏡スライドを準備するには、希釈したサンプル10マイクロリットルをきれいな顕微鏡スライドにピペッティングし、サンプルをカバースリップで覆います。

複合光学顕微鏡を明視野モードで使い、100倍から400倍の総倍率でサンプルを観察し、細胞の運動性、形態、持続頻度を適応状態の指標として評価します。7日ごとに、各培養液の体積比20%を同じガリ濃度と滅菌条件で新たに準備したキャッサバ培地に無菌移送します。30グラム/リットルのキャッサバ培地で、配管間での移動量を一定に保ち、培養物が安定した成長、持続的な運動性、低頻度の持続を示すまで連続的に再配序します。

高濃度キャッサバの適応と比較成長分析の後、比色ストリップを使用してシアン化物のレベルを評価し、現れた色を観察します。遠心分離後、バイオマスを収穫して下流分析を行います。完全な暗栽培条件下では、ガリットルあたり30グラムで栽培した菌種は、低濃度よりも高い統合成長を示しました。

10〜20グラム/リットルの低いガリ濃度では検出可能でしたが、成長は減少し、変動も大きいです。40〜50グラム/リットルの高濃度では細胞密度のピークが上昇しましたが、安定化が遅れ、変動が大きくなりました。トリパンブルーの排除アッセイでは、30グラム/リットルのガリで維持された培養は、サンプル対象の期間を通じて高い生存率を保持することが示されました。

ガリ濃度が高い場合、生存率の一時的な低下が見られ、その後部分的な回復が続き、時間とともに変動が増加しました。良好なアウトカムとしては、運動性が低下し、繰り返しのサブカルチャーでも保持された丸みを帯びたまたは半強調された細胞が含まれていました。適応したE.gracilis培養は複数の基質タイプにまたがって再現可能な成長を示し、野生型培養に比べて後期段階の衰退が減少し、より早く安定化を示しました。

プロトコルの成功裏の実装により、外部の実験室解析で燃焼デュマス法を用いた定量化された粗タンパク質含有量のE.gracilisバイオマスが得られました。適応培養で観察されたタンパク質の割合は、バイオマス蓄積の増加に伴う総タンパク質産出量が高い野生型培養と同等でした。このプロトコルにより、研究者はユーグレナの成長、シアン化物削減、バイオマス生産、栄養ポテンシャルを異なるキャッサバ系環境で研究できます。

このプロトコルの重要な課題は、ユーグレナの成長のために安定した温度、一貫した培養条件、そしてバランスの取れた微生物群集を維持することです。今後の研究では、このプロトコルの最適化とスケールアップ、タンパク質収量の向上、多様なキャッサバ廃棄物流を用いた大規模な産業応用の試験が期待できます。