Name: ユー グリーナ・グラシリス をキャッサバベースの基質に異栄養栽培として適応させる方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 学ぼう、Euglena gracilisをキャッサバ由来基質に適応させる多段階プロトコル。異栄養栽培による頑健な藻類系統の確立と、廃棄物価値化への応用可能性を評価する方法です。

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<table><tbody><tr><td>オートクレーブ - 533LS スチーム 滅菌器</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>キャッサバ培地のスチーム滅菌。 液体サイクルを使用して培地を滅菌。</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; ヘマサイトメーター 交換用 カバーガラス</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>ヘマサイトメーター用の特別な厚いカバーガラス。</td></tr><tr><td>キャッサバ乾燥 パルプ</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>提供されたキャッサバ基質</td></tr><tr><td>キャッサバペレット</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>提供されたキャッサバ基質</td></tr><tr><td>キャッサバの皮</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>提供されたキャッサバ基質</td></tr><tr><td>キャッサバ 基質 (ガリ)</td><td>地域のサプライヤー</td><td>N/A</td><td>キャッサバ由来のガリ 炭素源として使用される フィードストック; 脱イオン水で準備。</td></tr><tr><td>遠心分離機 サーモ サイエンティフィック ソラベル ST16 遠心分離機</td><td>サーモ サイエンティフィック ソラベル ST16 遠心分離機</td><td>75004241</td><td>3,500 × g以上が可能で、バイオマスの回収に使用。</td></tr><tr><td>遠心分離管 例：Axygen (A Corningブランド)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>無菌、最小1.5 mLの容量</td></tr><tr><td>クリーンウォーター 例：UltraPure&trade; DNase/RNase- フリー蒸留水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>脱イオンまたは蒸留。培地の調製に使用。</td></tr><tr><td>複合光学 顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>日常的な細胞観察と数えに適した標準的な複合顕微鏡。</td></tr><tr><td>シアン化物テスト ストリップ、 比色法。 CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>半定量的なシアン化物の検出。有害廃棄物として処分</td></tr><tr><td>滅菌済み標準 計量ボート</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>キャッサバ基質と乾燥バイオマスの計量に使用。</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (適応された 系統)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>この研究で生成されたキャッサバ適応株</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (野生型)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>非適応参考株。同じ標準条件を維持。</td></tr><tr><td>Euglenaの成長 培地 成分</td><td>様々な</td><td>N/A</td><td>標準的な実験室製剤に従って調製された基本Euglena培地。</td></tr><tr><td>FreeZone 6リットル コンソール冷凍 乾燥機</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>バイオマス脱水に使用。</td></tr><tr><td>標準 ライン付きヘマサイトメーター</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>手動細胞数算用。</td></tr><tr><td>ホットプレート付き マグネティックスターラー</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>オプション; 培地調製と基質懸濁液中の一貫性を向上。</td></tr><tr><td>マイクロピペット (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>無菌液体移送用に調整可能な容量ピペット。</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>オプション; バイオマス回収時の迅速なペレティングを促進。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>換気キャップが利用できない場合にフラスコやプレートの仮封に使用。</td></tr><tr><td>pH指示薬 ストリップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>培地の迅速な定性評価のためのpHメーターに代わる。</td></tr><tr><td>pHメーターと プローブ サーモ サイエンティフィック オリオン Star A211 ベンチトップpH メーター</td><td>サーモ サイエンティフィック オリオン Star A211 ベンチトップpH メーター</td><td>13-645-519</td><td>使用前に校正。培養上清のpH測定用</td></tr><tr><td>冷蔵 保管 (4℃)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>培地の短期保管</td></tr><tr><td>シェイキング インキュベーター (暗)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>100-150 RPM、温度範囲 24-28℃のオービタルシェイキングインキュベーター; 異栄養Euglenaの成長をサポートするために暗条件で使用。</td></tr><tr><td>スプレーボトル (32オンス)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>ベンチトップ滅菌と定期的な無菌処理 (70% エタノール溶液) に使用。</td></tr><tr><td>スプレッドシート ソフトウェア</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>データ収集、組織化、分析</td></tr><tr><td>滅菌済み ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>P20、P200、およびP1000ピペットと互換性のある滅菌済みの使い捨てチップ。</td></tr><tr><td>滅菌済み 血清学的 ピペット (5、10、 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>培養移送とサンプリングに使用する個別包装された滅菌済みピペット。</td></tr><tr><td>トリパンブルー 溶液 0.4%、液体、 滅菌濾過済み、 細胞 培養用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>トリパンブルー除外アッセイによる細胞生存能力評価に使用するバイタル染色。</td></tr><tr><td>サンプル用チューブ 収集 (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>pHとシアン化物のサンプリング用</td></tr><tr><td>換気キャップ付き エルレンマイヤー フラスコ (250-500 mL)</td><td>Corning&reg; 250 mL ポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ 換気キャップ付き</td><td>431144</td><td>換気キャップ付きポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ; オートクレーブ可能; 滅菌および非滅菌の両方の液体培養

ユー グリーナ・グラシリス をキャッサバベースの基質に異栄養栽培として適応させる方法

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

以下の代表的な結果は、記載されたプロトコルが成功裏に適用された場合の期待される結果と、最適でない条件下で観察される結果の範囲を示しています。これらの結果に対応する代表的なデータは 図1、 図2、 図3、 図4、 図5、 図6、 図7に示されています。これらの結果は、異栄養型の完全暗培養条件下でキャッサバベースの基質にE . gracilis を適応させる際の成長動態、生存可能性、形態、タンパク質の結果を解釈するための実践的な指針を提供します。さらに、これらの結果は、適応の成功、持続的な成長、高い生存可能性、安定した形態、基質間での一貫した性能、測定可能なタンパク質産生など、プロトコルの主要な生物学的成果を検証しています。
実験全体を通じて、1回の処理で3回のレプリケート(すべての種類のキャッサバ培地)が使用されました。複製数は上記のプロトコルに従うグループの裁量と物流上の制限に委ねられることを認識しています。このプロトコルの成功により、完全に暗い条件下でガリ系培地においてE . gracilis の持続的な異栄養成長が見られます。良好な結果は、滑らかでシグモイド型の成長軌跡、複製株間の発散が限定的であること、そして安定した後期段階の細胞密度が特徴です。適応集団で一貫して観察された良好な結果を示す形態的形質には、細胞の丸みや厚い細胞膜が含まれていました。対照的に、不健康な崩壊細胞は通常、不規則で断片化している、または構造的に損なわれたように見え、生存率が低下する傾向があり、適応培養で見られる完全な丸みや半嚢胞型と区別されます。参考までに、特徴的な細長い形態を示す野生型 E. gracilis の代表的な画像(図8)を含めており、基線的な細胞構造と適応または変質した形態を区別しています。30gのL-1 ガリで培養した培養は、低濃度に比べて成長曲線下面積(AUC)で測定される統合成長がより高く、キャッサバ基質の効率的な利用と生理学的適応の成功を示唆しています(図1)。
最適でない結果は、より低いガリ濃度(10–20 g L-1)で一般的に観察され、成長は検出可能ですが、規模は減少し、複製ごとに変動が大きいです。より高い濃度(40〜50 g L-1)では、培養は細胞密度のピークに達することがあります。しかし、これらの状態はしばしば安定化の遅れや時間的変動の増加を示します(図2)。
成功した実験では、培養期間を通じて細胞の生存率は高いままで、実験中の変動はわずかなものにとどまります。トリパンブルー排除アッセイは、30gのL-1 ガリで維持された培養液が、サンプル時点において生存可能(染色されていない)細胞の割合が高いことを示しています(図3)。染色細胞の割合の増加、運動性の低下、丸みを帯びた形態や崩壊した形態へのシフトなど、このパターンからの逸脱は最適でない状態を示し、トラブルシューティングの早期トリガーとなることがあります。生存可能性および形態学的評価は、細胞の完全性、方向性運動性、細長い形態と丸みを帯びた形態や崩壊型の相対的有病率など、一貫した観察基準に基づいて行われました。
最適でない結果は、生存率の一時的な低下を特徴とし、特に高濃度のガリで観察されます。部分的な回復は後の時点で観察されることもあります。しかし、これらの条件は培養期間を通じて生存率の変動が増加します(図4)。これらの成長パターンは、中間的な基質濃度(例:30 g L-1)が栄養素の利用可能性とストレスのバランスを提供し、より安定した成長をもたらすことを示しています。これらの傾向は、前処理条件や段階的適応が培養性能に与える影響を反映しており、基質複雑化への徐々の曝露が生理的安定性の向上と再現性のある成長行動を支えるためです。濃度が低いとバイオマス生産が制限され、濃度が高いと変動が大きく安定化が遅れます。
形態学的評価は適応状況の定性指標を提供します。良好な結果としては、運動性が低下した丸みを帯びた半嚢胞細胞が出現し、繰り返しのサブカルチャリングでもそのまま残ることが挙げられます(図5)。
対照的に、野生型株や初期適応に関連する最適でない培養は、細長く運動性のある細胞から不規則または崩壊した形態へ急激に移行し、成長安定性の低下と一致します。
このプロトコルを、果肉、ペレット、皮など追加のキャッサバ由来基質に適用すると、適応した E. gracilis 培養は複数の基質タイプで再現性のある成長を示します。良好な結果は、野生型培養に比べて成長曲線の早期安定化と後期段階の衰退減少が特徴です(図6)。
最適でない結果としては、成長開始の遅延や複製変動の増加があり、特に物理的異質性の高い基質では顕著です。
プロトコルの成功裏の実装により、外部実験室解析(Combustion(Dumas)法を用いて定量化された粗タンパク質含有量を持つ E. gracilis バイオマスが得られます。適応培養で観察されるタンパク質の割合は野生型培養と同等であり、総タンパク質産出量が高いほどバイオマス蓄積の増加に対応しています(図7)。
培地化学のモニタリングにより、適応中の培養基質相互作用が支持され、pHおよびシアン化物測定のプロトコルに含まれることが検証されました。pH値は時間とともに徐々に変化し、代謝活動や基質利用を示し、適応培養ではより安定した傾向が見られました。シアン化物の測定もこれを裏付けており、適応培養では検出可能な濃度が減少した一方で、野生型培養ではより変動が続いていました。これらの結果を総合すると、これらのモニタリングステップが適応に伴う培地化学の変化を効果的に捉え、培養性能の解釈を支えていることが示されています。基礎となるメカニズムは調査されていませんが、これは特に産業規模の応用において将来の研究において重要な分野を示しています。
長期的な維持と定着作業は、適応した Euglena gracilis 系統の長期にわたる存続を支えました。繰り返しの継承によって維持された培養は、維持サイクルを通じて運動性、特徴的な形態、安定した成長行動を一貫して保持しました。長期的な性能は定量的に評価されませんでしたが、これらの観察は適応した系統が指定された条件下で信頼性を持って維持可能であるという代表的な証拠を提供します。
これらの結果を総合すると、適応プロトコルがキャッサバ基質上でE . gracilis の強固な成長、生存可能性、バイオマス生産を支援し、安定した性能と時間経過によるシアン化物レベル低下を支持することが確認されます。
すべての図と表は別ファイルとして提供されており、原稿文書内に埋め込まれているわけではありません。図や表の配置の好みは、原稿本文内で括弧付き注釈で示されています(例:(図1))。特に指定がない限り、すべての図と表は最終出版物の代表者結果セクションの下に掲載されることを意図しています。
すべての図は個別のファイルとして提出され、複数パネルの図は単一の合成画像として提供されます。顕微鏡画像には各パネルにスケールバーが含まれています。データ図には測定単位が定義されたラベル付き軸が含まれ、誤差バーは対応する図の凡例で指定されています。
すべての表は個別の.xlsまたは.xlsxファイルとして提出され、装飾的なフォーマットなしの生または要約された数値データを含みます。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
図1:10、20、30 gL-1 garriで完全に暗い条件下で培養したE. gracilisの成長動態。 各基質濃度ごとに平均細胞密度が時間とともに示されます。誤差バーは生物学的複製におけるSEMを表しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
図2:ガリ濃度(30–50 g L-1)を高くしたE. gracilisの成長パフォーマンス。 細胞密度の軌跡は、基質濃度が高い場合におけるピーク密度、安定化タイミング、変動の違いを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
図3:トリパンブルー排除法で測定した30 gL-1 garriで培養したE. gracilisの細胞生存傾向。 サンプリングされた時間点を横断した生存細胞の割合を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
図4:高濃度のガリで培養された E. gracilis の生存率変動。 細胞生存率の一時的な変化が実験期間を通じて示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
図5:適応した E. gracilis 個体群の代表的な形態。 代表的な逆光顕微鏡画像では、適応後に観察される丸みを帯びた半嚢胞細胞が観察されています。スケールバー=XX μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
図6:キャッサバ由来基質における適応型および野生型 E. gracilis の成長パフォーマンス。 複数のキャッサバ製品で栽培された適応型および野生型培養の成長軌跡が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
図7:キャッサバ栽培の E. gracilis バイオマスの粗タンパク質含有量および総タンパク質排出量。 タンパク質含有量はSGS燃焼法(Dumas)を用いた外部解析によって定量化されました。総タンパク質の出力とバイオマス蓄積量が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
図8:標準条件下での野生型E. gracilisの代表的な形態(40倍倍率) 健康で適応していない Euglena gracilis の代表画像で、光学顕微鏡下で特徴的な細長い形態が見られます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>

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