Name: ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mRNA翻訳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶショウジョウバエ溶解液を用いた細胞フリーin vitro mRNA翻訳法。Drosophila胚由来リゾートでタンパク質合成と翻訳制御メカニズムを研究する実験手法を解説。複数種への適用と再現性評価も含む。

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<table><tbody><tr><td>アルミニウム箔シート</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>標準的な家庭用アルミニウム箔。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>アミノ酸混合物</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>アップルサイダービネガー</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>市販のアップルサイダービネガー（5％酸味）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>リンゴまたはグレープフルーツジュース</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>市販のグレープジュース。もしくは同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>細菌学的アガー&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ホウ酸 (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent、分子生物学グレード、&ge;99.5％、粉末。TBEバッファの調製に使用。</td></tr><tr><td>キャップ：アンチリバースキャップ (ARCA)：3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNAキャップ構造</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>キャップ：m7G(5')ppp(5')G RNAキャップ構造類似体</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>キャップ：機能しないキャップ類似体 G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>遠心分離管 (15 mL)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>完全、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ウサギの筋肉からのクレアチンホスホキナーゼ</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>クレアチンリン酸、二ナトリウム塩</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>脱水ベーカーズイースト</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>市販の活性乾燥酵母。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97％(NNR)</td></tr><tr><td>DNAクリーン＆amp;コンセントレーター-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ野生型株オレゴンR</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogasterの変異株、そしてvirilis、pseudoscura、grinshawi、hydeiなどの他のDrosophila種の野生型基準株もこのストックセンターで提供されている。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS試薬、99.4-100.6％、粉末。TBEバッファの調製に使用。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5％(滴定)</td></tr><tr><td>過酸化水素 (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>市販の（約2.5-3.5％過酸化水素溶液）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>in vitro転写mMessage mMachine T7、T3、またはSP6キット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344とAM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc、KCH3COOとも呼ばれる</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lbブロス（レンナックス）</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7、T3、またはSP6 in vitro転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316とAM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2、Mg(CH3COO)2とも呼ばれる</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl（塩化ナトリウム）</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS試薬</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>任意の会社</td><td>N/A</td><td>配列に依存する。</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5Xバッファ</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200マイクロリットルの黄色いチップ。</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1mlの青いチップ。</td></tr><tr><td>ピペットチップ&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10マイクロリットルの透明チップ。</td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS試薬グレード、&ge;99.5％、液体。</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mLガラスペステル組織グラインダー</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprepスピンプラスミドミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ウサギの網状小胞体溶解物（RRL）</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>レンリラルキフェラーゼ（RLuc）アッセイシステム</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNAクリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析カセット</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (ただし、分子サイズカットオフによって異なります)。</td><td>N/A</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>市販の漂白剤（約5-6％NaOCl）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ステンレス製ふるい</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任意の商業サプライヤー。</td></tr><tr><td>Taq plus精密DNAポリメラーゼ</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>牛の肝臓型XIからの転移リボ核酸（tRNA）</td><td>

ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mrna翻訳

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mRNA翻訳

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

本研究では、昆虫の発生における様々な段階でのタンパク質合成および翻訳制御を研究するために、ショウジョウバエ無細胞翻訳系を用います。このプロトコルは、遠縁の後生動物由来のライセートとは異なり、昆虫の発生に特異的なin vivoでの翻訳イベントを正確に再現します。まず、Benchlingクローニングソフトウェアを開きます。T7プロモーターの下流に、5'非翻訳領域、ホタルルシフェラーゼ（Flucリポーターシストロン）、3'非翻訳領域、およびポリアデニレート（poly(A)テール）を含む構築物を挿入するための適切なプラスミドを選択します。転写前に、poly(A)テールの直下にあるKPN1の一価制限部位を使用して、各プラスミド構築物を線状化します。in vitro転写のテンプレートとして使用する前に、シーケンシングによって得られた構築物のピークが鮮明で十分に分離していることを確認してください。線状化したDNAを1%アガロースゲル電気泳動にて100 Vで1時間分離します。線状化したDNAをゲル抽出します。それをマイクロチューブに入れ、DNA精製用のアガロース消化バッファー（ADB）を加えます。チューブをサーモシェーカーでインキュベートします。次に、内容物をカラムに移し、遠心分離して直線化DNAを回収します。in vitro 転写キットを用い、製造元の手順に従って直線化DNAを転写します。サーモサイクラーにセットし、適切なプログラムを選択します。転写後、すべての転写反応液をRNase-free DNaseで処理し、DNAテンプレートを除去します。製造元の指示に従い、塩化リチウム沈殿法を用いて転写産物を精製します。分光光度計を用いて、精製した転写物の量を定量します。1%アガロースゲル電気泳動（100 Vで1時間）により、メッセンジャーRNAまたはMRNAの完全性を評価します。mRNAを分注し、使用時まで-80°Cで保存します。対照群として用いるキイロショウジョウバエ（drosophila melanogaster）野生型系統Oregon-Rを飼育するために、長さ約1m、直径50cmの円筒形アクリルケージを用意し、上部に直径約30cmの開口部を設けます。上部の開口部をメッシュで覆い、四方をテープで密封します。ハエに水分を供給するため、メッシュの上に濡れた紙を置き、これを毎日交換します。ケージの前方を openness に保ち、アクセスしやすいように布で覆っておきます。増殖させたショウジョウバエ株から、約 1,000 匹の若いハエを、22 to 25 °C で維持しているケージ内に投入します。餌の準備として、エッガー果汁プレートの上に再水和させたパン酵母をスプーン1杯分盛り付け、その後、プレート全体に 200 µL の酢を均一に加えます。フィードプレートをケージ前面の開口部から

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

私たちはここからmRNAおよび代謝物の抽出および精製するための手順について説明し...

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。...

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化キイロショウジョウバエ

タンパク質合成制御は主に翻訳開始段階で行われ、その欠陥は多様な障害に関連しています。それらの病因をよりよく理解するために、ここでは、翻訳開始因子eIF4G1の変異体の存在下でmos転写産物の翻訳を評価するXenopus...

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

Translating Ribosome Affinity Purification...

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。...

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

この記事では、ハエでRNA標的Cas13D酵素(RfxCas13D)を使用するための詳細なプロトコルを概説します。...

CRISPR/CasRxを用いた ショウジョウバエメラノガスター におけるユビキタスおよび組織特異的RNAターゲティング

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

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ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mRNA翻訳

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