コーティングされたフィルターおよびプレフィルターがエアロゾル化したPhi6ウイルスの感染力および濃度に与える影響の評価

私たちは、室内環境における空気感染率および濃度を低減する効果を調査します。現在のアプローチでは現実的な気流ダイナミクスが見落とされています。当プロトコルはエアロゾル条件を再現し、感染ウイルスと総ウイルス量の両方を測定します。

まず、精製したphi6バクテリオファージの懸浮液を、pH7.2に調整した1ミリモラ塩化マグネシウムを含む20ミリモラルリン酸カリウムバッファーに希釈します。バイオセーフティキャビネット内のすべてのフィルター、プレフィルター、抗ウイルスコーティング材料を組み立てて表面試験を行います。銅、または銅・銀の有効成分を独自マトリックスに埋め込むすべてのコーティング材料(すなわち、A6、B4、VS、VSなど)を平面試験板上で評価します。

次に、薄めたphi6バクテリオファージストック溶液20マイクロリットを被覆されたテストピースにピペットで抽出し、表面生存可能性測定を行います。無菌ガラスの三角形を使って、2×2センチメートルの範囲に均等にサンプルを広げます。サンプルは22度Cで最大4つの時間点(1分、5分、1時間、3時間)培養します。

各時間点ごとにウイルスを回収するために、表面に新鮮なLBブロスを180マイクロリットル加えます。表面をピペットで10〜20回繰り返し洗浄してサンプルを採取します。プラスチック製のペトリ皿をコントロール面として使う。

感染性ウイルス粒子の数を測定するためのプラークアッセイと、ウイルスゲノムコピー数を決定する定量逆転写化剤ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて表面コーティングの抗ウイルス効果を定量化します。先に示したように精製・濃縮されたphi6バクテリオファージ懸濁液を希釈すると、ウイルス濃度は1ミリリットルあたり2.5×10の乗、4.08×10の11の撲の11のべき乗の範囲に到達します。次に、同じ蓋を持つ円筒形ガラスボディを使って実験用エアロゾルチャンバーを組み立てます。

内部の金属足場をチャンバーに挿入し、絶縁ガスケットを固定して気密性を確保します。ネブライザーとエアポンプを組み合わせて、ウイルスエアロゾルの安定的かつ再現可能な入力を生成します。実験の前後にネブライザーに使われるウイルス溶液を調整し、安定性を監視してください。

チャンバー内のエアロゾル流量を毎分8リットルに設定します。長時間の測定時に湿度を下げるには、エアロゾル流量の約4分の3を高効率の粒子状空気(HEPA)フィルターを通して排気に導きます。残りの4分の1の流量を1分間に2リットルに相当します。

じょうごを使ってエアロゾルの流れをチャンバー内のフィルターまたはプレフィルター面に導きます。HEPAフィルターと流量計を過剰な湿気から保護するために、乾燥機を使って排出空気の流れを除湿してください。外部ポンプを用いてシステム内に負圧を作り、さらに気流を支えて排気口からの効率的な排気を確保します。

エアロゾルチャンバー内の二層ガラス繊維材料と並べて、コーティングされていないまたはVSBコーティングされたポリエステルおよびブルプレンプレフィルターの抗ウイルス特性を評価してください。インパクションサンプリングによる抗ウイルス効果を評価するために、pH7.2の20ミリモラHEPESバッファーを含むペトリ皿を試験前フィルターの真下に置き、粒子の沈着を最大化します。あるいは、GF2フィルターの抗ウイルス効果を試験するために、外部ポンプに接続した三ノズルの全ガラススワーリングインピンジャーを設置してエアロゾル採取を行う方法もあります。

テスト用プレフィルターやフィルターを通る空気の流れを毎分2リットルに保ちます。チャンバー出口の後に追加のバルブを使って、総空気流入量を毎分10リットルに増やします。エアロゾルを20ミリモラHEPESバッファー5ミリリットルに捕捉します。

蒸発バッファーは30分ごとに補充してください。三重サンプリングの場合、各実験の前後15分間、プレフィルターやフィルターなしでコントロールランを実施します。事前実験制御実行後、フィルターまたはプレフィルターをチャンバーに挿入し、システムを3時間運転します。

20ミリリットルのバッファーを含むペトリ皿から30分ごとに1ミリリットルの懸濁液を回収し、ウイルスエアロゾルを採取します。フィルターを外し、実験後のコントロールランを実施します。実験中は30分ごとにサンプルを採取し、各実験で8個のqRT-PCRおよび滴定サンプルを得ます。

インピンガー実験では、3時間の実験終了時に滴定サンプルを一度だけ採取します。収集したサンプルのうち800マイクロリットルをqRT-PCR分析に、残りの200マイクロリットルをウイルスの滴定に使用します。qRT-PCRサンプルを液体窒素でスナップ冷凍し、80度で保存します。

ウイルス滴定サンプルはプラークアッセイを用いて即座に処理します。表面の生存可能性アッセイでは、すべての試験されたコーティングがウイルスを不活化し、最初の5分以内に有意な減少が観察されたことが示されました。銅系表面コーティングB4は最も速い減少を実現し、感染者数を5分以内に3桁減少させ、検出限界を100個のプラーク形成ユニット/ミリリットル未満に15分で抑えました。

A6コーティングは25分以内にウイルスを完全に不活化し、VS Bは60分で完了しました。VSコーティングは試験材料の中で最も遅い不活化速度を示しました。研究対象のプレフィルターであるBP6、S11、FMR5は、無フィルター対照群と比べて感染性ウイルスを通過する能力を1.5〜2桁次に減少させる効果を均等に示しました。

GF2フィルターは優れた性能を示し、ウイルス負荷を少なくとも6桁に低下させ、検出限界内で感染性のphi6ウイルスプラークは検出されませんでした。VS Bコーティングは、コーティングされていないプレフィルターと比較して感染性ウイルスのろ過効果に有意な影響を与えませんでした。qRT-PCRの結果は、プレフィルターがウイルスのゲノムコピー数を最大2桁減少させることを示しました。

GF2フィルターは、フィルターなしコントロールと比べて最大4桁の減少を示しました。最初の30分間はプレフィルターと制御の違いはほとんどなかったものの、機械的なフィルター効率は60分以降増加しました。さらに、VS Bコーティングの適用はろ過培地を通過するウイルスゲノムの数に測定可能な影響を与えませんでした。

このプロトコルにより、研究者はウイルスの不活化、ろ過効率、感染性粒子と総ウイルス量の違いを定量化できます。主な課題は、空気流中のウイルス表面接触時間が非常に短く、抗ウイルスコーティングの効果を制限することです。今後の研究では、コーティングとUVの組み合わせや、実際の換気システムや多様なウイルスでの性能試験を検討することができるでしょう。