CRISPR/Cas9を媒介したカエノラブディティス・エレガンスにおける生殖細胞特異遺伝子の内因性蛍光タグ付け

CRISPRベースの内因性タグ付けを用いて、C. elegansにおける生殖細胞タンパク質の局在と動態を研究しています。従来のトランスジーンは生殖細胞の発現に影響を与えることがありますが、このプロトコルは内因性遺伝子座のタンパク質をネイティブコントロール下にタグ付けします。まず、公開データベースや文献を用いて、生殖腺や生殖細胞で主に発現する候補遺伝子を特定します。

ターゲットタンパク質のUniProtエントリを開いた後、「構造」をクリックして構造的特徴やタンパク質ドメインを評価し、適切な蛍光タグ付け部位を特定します。モデルの信頼度値を確認するために、AlphaFoldデータベースのエントリをスクロールして開いてください。具体的な構造分類はドメインをクリックしてください。

次に、WormBaseでターゲット遺伝子ページを開きます。下にスクロールして「シーケンス」ウィジェットをクリックし、主要な書き起こしリンクから書き起こしページを開きます。シーケンスセクションまでスクロールし、選択したトランスクリプトのスプライスされたシーケンスを表示する特定のオプションをクリックしてください。

IDTツールページからgRNA配列をコピーし、挿入ダイアログボックスに貼り付け、挿入をクリックしてスペーサーをCRISPR発現プラスミドに統合します。gRNA挿入の精度を確認するには、配列を選択し、「アラインメント表示」をクリックして、サンガーシーケンシングの結果をベースごとに期待配列と比較してください。ドナープラスミドを構築するには、WormBaseからホモロジーアームのゲノム配列をコピーします。

SnapGeneでシーケンスを貼り付けて「挿入」をクリックします。次に挿入部位を右クリックして「Set DNA Color」ウィンドウを開き、オレンジに変更して接合点をマークします。緑色蛍光タンパク質またはGFPインサート配列をコピーし、マークされた位置に直接貼り付けます。

次に「機能を追加」をクリックします。特徴をGFPに名付けてください。ディスプレイの色を緑色に変更し、OKをクリックしてインシリコドナーのプラスミドアセンブリを完成させます。

統合後のCas9再切断を防ぐために、ドナープラスミドテンプレートにサイレント置換を導入するために、発現ベクターから19ヌクレオチドgRNAスペーサーをコピーします。ドナープラスミドタブで、配列をFind DNA配列検索バーに貼り付けて標的部位を特定し、変異させる特定のヌクレオチド位置を選択します。「塩基置換」に「新しいヌクレオチド」を入力し、「挿入」をクリックします。

修正された塩基を右クリックし、「Set DNA Color」を使って色を赤に変えます。ドナープラスミドのサンガー配列決定結果を予想配列と整列させ、完全性を確認します。CRISPR発現プラスミド、ドナープラスミド、共注入マーカーを無菌二重蒸留水で組み合わせ、示された濃度で最終体積10マイクロリットルにして注入ミックスを準備します。

その後、混合物を10,000gで遠心分離し、10〜20分間粒子状物質を除去し、マイクロインジェクション毛細血管の詰まりを防ぎます。針引き手を使って、ガラス毛細血管から長くテーパーと鋭い先端を持つマイクロインジェクション針を作り、ゴナダル注射に適したものを作り、極性設定を経験的に最適化します。マイクロキャピラリーピペットを加熱し、2つに割ってローディングツールを作ります。

短縮されたマイクロキャピラリーピペットの広い端にゴム製の吸引バルブを取り付けます。約1マイクロリットルの注入ミックスをローダーに吸引します。ローダーを注射針の後端に差し込み、注射ミックスを優しく注ぎます。

針を水平に10分間置き、連続したカラムを作り、溶液が先端に沈殿するのを待つ。注射顕微鏡に針を取り付け、明視野光学で先端をピント合わせします。ハロカーボン油に浸したカバースリップの縁に優しく触れて針先を開け、流れを確認します。

注射用に培養するには、N2野生型ミミズをOP50バクテリアシード培地に保持してください。健康なプレートからL4段階の両性具有者を選び、20度Cで10時間孵育することで、発達した生殖系列を持つ若年成虫を得ます。細菌の残留を減らすために、ミミズを種付けされていないプレートに移します。

ガラススライドの上に乾燥した2%アガロースパッドを用意します。そしてハロカーボンオイルを一滴垂らします。まつげピッカーを使ってミミズをアガロースパッドに移し、動けなくします。

注射のために低倍率の対物レンズを使って性腺の向きを合わせてください。マイクロマニピュレーターの操作を使って、針をワームに対して20〜40度の角度で配置します。高倍率で遠位生殖細胞にピントを合わせてください。

寄生虫を針に乗せ、先端を性腺合胞体内に位置させます。溶液を注入して性腺が腫れるまで注ぎます。針を抜き、次の注射のために位置を戻してください。

M9バッファーを加えてアガロースパッドを柔らかくし、部分的に砕いて寄生虫を放出します。各ワームを個別のリカバリープレートに移します。その後、20〜25匹の寄生虫に繰り返し注射を行います。

F1子孫を共注射マーカーでスクリーニングし、マーカー陽性動物を選択。各F1ミミズを個別のプレートに移し、産卵のために1〜2日を設けます。各F1ミミズをプロテナーゼKバッファーで溶除し、PCRテンプレートを準備します。

ホモロジーアームの外側にゲノムプライマー1つ、内部タグプライマー1つを用いて接合PCRを行います。PCR陽性のF1動物から対応するプレートを保持します。PCR陽性のF1系統からF2子孫を個々のプレートに分離し、子孫を産出します。

遺伝子型解析のためにライス成体を使います。ホモロジーアームの両側にプライマーを配置して、生成物サイズで野生型対立遺伝子とノックイン対立遺伝子を区別するPCRを行います。SnapGeneツールを使って、サンガーのシーケンス結果を期待される編集ゲノム配列と整合させることで、左・右の挿入接合部の両方で正しい統合を検証・検証します。

蛍光顕微鏡を用いて生殖細胞の発現と局所を検証します。確認されたホモ接合系譜を拡大する。長期保管のために在庫を維持し、検証済みラインを冷凍保存してください。

F1子孫のPCRスクリーニングでは、1つの側ゲノムと1つの内部GFPプライマーを用いて、1,550塩基対接合PCRアンプリコンによって成功したノックインが確認されました。ほとんどのF1動物で1,550塩基対バンドが欠如していることは、標的統合が検出されないことを示しており、ホモロジー指向修復ではなく非統合的DNA伝達と一致しています。接合PCR陽性系統から導かれるF2子孫の接合性決定により、野生型対立遺伝子として1,345塩基対、ノックイン対立遺伝子として2,344塩基対で対立遺伝子を区別します。

ヘテロ接合体は両方の帯を示します。ホモ接合ノックインサンプルは野生型サイズのバンドを欠き、統合に失敗したサンプルは野生型サイズの生成物のみを示します。ホモ接合GFPノックインラインの追加検証は共焦点顕微鏡イメージングを用いて行われ、生殖細胞細胞内でGFP蛍光が精子形成領域でシグナルが濃縮されたことが観察されました。

このプロトコルにより、C. elegansの生殖系統におけるタンパク質の局在および動態のin vivo解析が可能になります。タンパク質機能を維持し偽陽性候補を最小限に抑えるためには、慎重なタグ設計と徹底的な検証が不可欠です。今後の研究では、このワークフローを用いてタンパク質の局在を追跡し、生殖系統発生中の相互作用の可能性を探ることができます。