Name: ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ ペプチドアレイとネイティブヌクレオソームプルダウンを用いて、ヒストンリーダーSPIN4のH3K4メチル化結合基質を同定する方法。骨成長制御と過成長症候群の研究に応用可能です。

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<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL マイクロ遠心分離機チューブ</td><td>サーステット</td><td>72.690.001</td><td>一般的な実験</td></tr><tr><td>15cm組織培養皿</td><td>サーステット</td><td>83.3903.300</td><td>一般的な実験</td></tr><tr><td>15 mL円錐遠心分離機チューブ</td><td>サーステット</td><td>62.554.101</td><td>一般的な実験</td></tr><tr><td>50 mL円錐遠心分離機チューブ</td><td>サーステット</td><td>62.548.004</td><td>一般的な実験</td></tr><tr><td>500 mL エルレンマイヤーフラスコ</td><td>ステラー・サイエンティフィック</td><td>CT229809</td><td>Sf9細胞培養</td></tr><tr><td>アマーシャムImageQuant 800 CCDイメージャー</td><td>シチバ</td><td>IMQ800</td><td>CCDイメージングシステム</td></tr><tr><td>アンチFLAG M2アフィニティジェル</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>A2220</td><td>生化学的なプルダウン</td></tr><tr><td>アンチFLAG M2抗体</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>F1804</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>HY-P0017</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>Array Analyze Sofrware</td><td>アクティブモチーフ</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>MODifiedペプチドアレイデータ解析</td></tr><tr><td>ASIアガロースLE</td><td>アルカリ・サイエンティフィック</td><td>A7700</td><td>DNAゲル</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac バクロウイルス発現系</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>10359016</td><td>基状血管発現</td></tr><tr><td>ベンザミジン塩酸塩</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>ハイW018781</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>A9647</td><td>タンパク質定量標準</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>A18469.08</td><td>ラメリバッファー</td></tr><tr><td>クーマッシー・ブリリアント・ブルー R-250</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>20278</td><td>プロチエンゲル染色</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>シグマ・オルドリッチ&nbsp;</td><td>D5545</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>RPIの研究成果物</td><td>E58100</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>増強化学発光(ECL)基質</td><td>シチバ</td><td>RPN2232</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>ESF 921 昆虫細胞培養培地</td><td>表現システム</td><td>96-001</td><td>Sf9細胞培養</td></tr><tr><td>エタノール(200プルーフ)</td><td>スペクトラム・ケミカル</td><td>ET107</td><td>DNA沈殿</td></tr><tr><td>EVOS M5000イメージングシステム</td><td>インビトロジェン</td><td>M5000</td><td>一般イメージング</td></tr><tr><td>FLAGペプチド</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>HY-P7006</td><td>プルダウン洗脱</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ・オルドリッチ&nbsp;</td><td>G77893</td><td>ストレージバッファ</td></tr><tr><td>H3K4me1抗体&nbsp;</td><td>アクティブモチーフ</td><td>39300</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>H3K4me2抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9725T</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>H3K4me3抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9751T</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>HEK293FTセル</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>R70007</td><td>ヒト胚性腎線維芽細胞株</td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>シグマ・オルドリッチ&nbsp;</td><td>H3375</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>イメージJ</td><td>国立衛生研究所</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp;Javaベースの画像処理プログラム</td></tr><tr><td>ロイプチンヘミスルフェート</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>HY-18234A</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>微小球菌ヌクレアーゼ(MNase)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>クロマチン消化のためのエンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>モデル120 ソニック・ディスメンブレーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FB120110</td><td>超音波処理</td></tr><tr><td>MODified ヒストンペプチドアレイ</td><td>アクティブモチーフ</td><td>13005</td><td>タンパク質結合アッセイ</td></tr><tr><td>ペプスタチンA</td><td>メドケムエクスプレス</td><td>HY-P0018</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼIgGフラクション モノクローナルヤギ抗マウスIgG、ライトチェーン特異的</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>115-035-174</td><td>ウェスタン・ブロット</td></tr><tr><td>pFastBac1-フラグ-SPIN4</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>10360014</td><td>バキュロウイルス発現ベクター</td></tr><tr><td>pFastBac1-フラグ-SPIN4-D82H</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>10360014</td><td>バキュロウイルス発現ベクター</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P2069</td><td>DNA精製</td></tr><tr><td>ピアース ラピッドゴールド BCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>PIA53226</td><td>タンパク質定量子</td></tr><tr><td>ピアースシルバーステインキット</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>24612</td><td>タンパク質検出</td></tr><tr><td>PMSFプロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>36978</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ポリアクリルアミドゲル</td><td>社内制作</td><td>該当なし</td><td>プロテインジェル</td></tr><tr><td>Sf9昆虫細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>バクロウイルス発現のための昆虫細胞株</td></tr><tr><td>スライド・A・ライザーMINI透析装置、10K MWCO</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>69572</td><td>タンパク質透析</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>S8750</td><td>DNA沈殿</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>一般的なバッファ</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>シグマ・オルドリッチ&nbsp;</td><td>L3771</td><td>一般的なバッファ</td></tr><tr><td>トライパンブルー溶液(0.4%)</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>15250061</td><td>核染色</td></tr></tbody></table>

ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(spin4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

このプロトコルでは、新しく合成された、または新生DNAに関連するタンパク質とヒストン修飾を調べるための新しいBrdU-ChIP-Slot-Western技術について説明します。...

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR...

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。...

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。...

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

学ぶ ペプチドアレイとネイティブヌクレオソームプルダウンを用いて、ヒストンリーダーSPIN4のH3K4メチル化結合基質を同定する方法。骨成長制御と過成長症候群の研究に応用可能です。

ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

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