単細胞および免疫蛍光解析のために雌マウス尿道上皮を単離する最適化方法

私たちのグループは、泌尿生殖器における上皮パターンの研究に関心を持っています。このプロトコルは、メスのマウス尿道の上皮内膜を分子および細胞解析のために分離するための最適化された方法を表しています。本論文で述べた方法は、女性の尿道内膜とその免疫防御における役割の研究に役立ちます。

まず、生後6〜12週のメスのCD1マウスを解剖台に仰向けに置きます。腹部に70%エタノールを吹きかけて髪を湿らせます。鉗子を使って腹部の皮膚を持ち上げます。

次に小さなハサミで下半身に向かって垂直に切開し、外側の尿道口で終わります。膀胱を特定し、鉗子で優しく持ち上げて、空で尿が出ていないことを確認します。ハサミを使って膀胱の周りの脂肪や結合組織を切り取り、恥骨結合部で二つの恥骨が合流する蝶のような構造を露出させます。

恥骨結合の下を走る尿道を観察してください。その後、恥骨結合を鉗子で持ち上げ、ハサミで切り開きます。恥骨の断片を取り除き、膣壁の腹面に横たわる細い尿道を露出させます。

細い鉗子を使って、膀胱を体腔から優しく引き上げます。尿道と膣壁の間にハサミを通して尿路と生殖器を分けます。尿道の奥に沿って切断し、膣壁から膀胱を分離しながら膀胱にわずかな緊張を保ちます。

遠位尿道口まで切り込み、全長のマウス尿道(長さ1.2〜1.5センチメートル)を得ます。次に、膀胱の首に一箇所を切って尿道と膀胱を分離します。カルシウムとマグネシウムを含まない新鮮なHBSSを入れた無菌のペトリ皿に4〜5本の尿道を溜めます。

解剖顕微鏡の下で、細かい鉗子とハサミを使って尿道周辺の脂肪と結合組織をトリミングします。次にハサミで各尿道を横向きに2つに切って同じ大きさの大きさの塊にします。組織のかけらを100ミクロンのナイロンメッシュストレーナーの上に置きます。

組織片を1ミリリットルのHBSSで洗浄し、その後、抗生物質および抗吸動薬を補足した1%トリプシン1ミリリットルを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。次に、サンプルを回転機で毎分30回転、摂氏4度で15〜30分間培養します。消化後、HBSSで調製した塩化マグネシウム10ミリモラを加え、その後PBSで調製したDNAse Iを1ミリリットルあたり10マイクログラムに加えます。

チューブを37度の交配オーブン内に置いた回転子で15〜30分間孵化させます。トリプシンを消滅するために、尿道組織を室温のHBSSで10%羊血清を含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。5分後に尿道組織を氷冷のHBSSを入れた新しいチューブに移し、さらに氷冷のHBSSを入れた滅菌ペトリ皿に移します。

顕微鏡でサンプルを観察する際、尿道の片側を鉗子で押さえます。別の鉗子を使って尿道片全体に沿って通し、透明な上皮層を押し出します。分離された尿道上皮シートの一部を直接処理し、全マウント免疫染色を行い、上皮細胞および上皮関連マクロファージを原位で可視化します。

小さなプラスチックピペットを使って、4〜5本のマウス尿道から分離したHBSSの上皮片を無菌培養皿に移します。はさみで上皮を小さな破片に刻みます。挽いた上皮細胞の断片を、1.5ミリリットルの予温アキュターゼ消化液を37度のマイクロ遠心分離管に入れます。

サンプルを37度の回転機で1時間培養します。培養後、カルシウムおよびマグネシウムフリーの1X PBSおよび1%BSAからなるウォッシュバッファー2ミリリットルを含む5ミリリットルの遠心分離管に全て移します。スイングバケットローターを使って600Gで4度の温度で5分間遠心分離します。

次に、優しい真空で上清液を吸引します。その後、1ミリリットルのフィルターチップピペットでペレットを1ミリリットルのウォッシュバッファーに再懸浮させます。ペレットを上下にピペットで砕き、塊が小さくなるまで続けます。

サスペンションを23.5ゲージと26.5ゲージの針に通し、それぞれ1ミリリットルの注射器に4回のストロークで接続します。次に、30ミクロンのプレセリーターフィルターを5ミリリットルのチューブの上に置いて表面を湿らせるために、ウォッシュバッファーを1ミリリットル追加します。26.5ゲージの針に接続された注射器を使い、セルの懸濁液を1ミリリットルフィルターに通します。

次に、1ミリリットルのウォッシュバッファーでチューブを洗い、フィルターを通してください。スイングバケットローターを使って、600Gで4度の遠心分離で5分間セルを掴みます。上清液を吸引してください。

ペレットを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸浮させ、赤血球溶解バッファー100マイクロリットルを加えます。ちょうど3分後に、4ミリリットルのウォッシュバッファーを加えて混ぜます。スイングバケットローターを使って、600Gで4度Cの温度で5分間遠心分離して細胞を収穫します。

ペレットを再懸浮させる前に、ペレットの大きさに応じて50〜200マイクロリットルの洗浄バッファーで上清液を除去してください。5マイクロリットルの細胞と5マイクロリットルのトリパンブルーを混ぜ、その混合物をヘモサイトメーターに搭載して細胞収量と生存率を評価します。フローサイトメトリーを用いて細胞生存率を評価し、異なる細胞集団を定量化します。

基底膜マトリックスとオルガノイド拡張培地で尿道上皮細胞を培養し、三次元尿道上皮オルガノイドを生成します。埋め込まれたオルガノイド切片に対してヘマトキシリン・エオシン染色および蛍光免疫染色を行い、オルガノイド構造と細胞組成を可視化します。分離後の尿道上皮鞘は、間質組織よりも透明性が高かった。

上皮鞘の全マウント免疫染色では、E-カデリンCDH1抗体による強い標識が認められました。F480抗体でシートを標識したところ、マクロファージが尿道の上皮細胞間で分岐した樹状突起構造を形成していることが示されました。尿道上皮から単離された単一細胞は、アミン反応性のゴーストダイV 450を用いた血液細胞計およびフローサイトメトリーでトリパンブルー除外により一貫して高い生存率を示しました。

分離された細胞は、生細胞にゲートを施した後、上皮細胞集団が濃縮されていました。CD45陽性免疫細胞の約1.3%と1.18%のマクロファージが単一細胞懸濁液で観察されました。尿道から分離された単一上皮細胞は生存可能であり、三次元マトリックス内でオルガノイドを形成し、培養中6日目まで観察されました。

ヘマトキシリン・エオシン染色により、尿道上皮オルガノイドには大きな中空オルガノイドと小型固形オルガノイドという2つの異なる形態が示されました。空洞型および固形尿道上皮オルガノイドは層化され、基底層でKRT5およびP63を発現しました。彼らは基底層および中間細胞層でKRT-13を発現させました。

近位尿道から生成されたオルガノイドは中空オルガノイドの割合が高い一方で、遠位尿道から生成されたオルガノイドはより固体の球体を形成しました。このプロトコルにより、研究者は近位および遠位尿道からの上皮細胞の種類と自己再生能力を研究できます。このプロトコルで最も重要な考慮事項の一つは、全長尿道の慎重な解剖と最適な酵素的消化を行い、下流解析のために生存可能な尿道上皮細胞を得ることです。

このプロトコルで生成される上皮細胞は、単一細胞RNAシーケンシング、バルクRNAシーケンシング、フローサイトメトリー、免疫染色、オルガノイド培養など、多様な用途に使用できます。