リンパおよび血液血管の同時サンプリングによる肝輸送経路評価のための包括的なラットモデル

当研究室は、炎症性および心血管代謝疾患におけるリンパ系の役割を研究し、これらの疾患を治療するためにリンパ系を標的とする薬物送達戦略を開発しています。このプロトコルは、薬物代謝、栄養フラックス、免疫シグナル伝達、肝臓応答など、多様な条件下での肝過程の評価を可能にします。まず、麻酔をかけたオスのスプラグ・ドーリーラット(体重約250〜300グラム)を、背側横臥状態で頸動脈と頸静脈から成功裏にカニューレしたものを外科顕微鏡下に置きます。

肋骨の約1.5〜2センチ下、中央線から右脇腹にかけて4〜5センチの水平皮膚切開をします。皮膚を引き戻し、外腹斜筋と内腹斜筋に合わせた切開を入れます。手術中に出会った大きな血管は焼灼または結紮してください。

生理食塩水で湿らせた綿棒を使って肝臓を横隔膜に、胃を左側、小腸を下側に移動させます。臓器は生理食塩水に浸したガーゼで引き戻しておきましょう。肝動脈に平行かつやや後方側に位置し、右腎の内側にあり下大静脈に隣接する肝リンパ管を特定します。

より大きな不透明または白い腸間膜リンパ管を解剖学的ランドマークとして用い、尾側に位置する半透明で狭い肝リンパ管を特定します。リンパ管と大静脈の上に覆われている結合組織を除去するには、直線のグレーフェ鉗子を使ってください。鉗子を右腎臓の下の脂肪床から挿入し、大静脈の下にトンネルを作ります。

鉗子を前進させ、先端が大静脈の反対側の肝リンパ管に平行に出るまで進めます。鉗子を使って用意されたカニューレの外端を掴み、トンネルの先端が反対側に出るまでカニューレを引っ張ります。Halstedのモスキート止血鉗鉗子を使って、25ゲージの針の先端を約90度に曲げます。

曲げた針を使い、操作者に最も近い右側の肝リンパ管を慎重に刺してください。カニューレに抗凝固液があらかじめ入っているか確認し、気泡があれば取り除いてください。面取り端をダクト内に約2ミリ挿入します。

カニューレの外側で約100マイクロリットル毎時のリンパ流を確認してください。流れが見られない場合は、カニューレを調整または再挿入してください。カニューレを採取側で塞ぎ、少量の獣医用接着剤を塗って挿入部位を固定します。

接着剤が乾いたら、チューブ内のリンパ流を確認してください。その後、ガーゼを外し、臓器を元の位置に戻します。抗凝固液を含む採取チューブをカニューレ出口の下に置き、リンパ液が滴るようにチューブ内に流れているか確認します。

その後、腹壁を縫合し、内腹斜筋、外腹斜筋、皮膚層を順に縫合します。肝リンパカニュレーション直後、頸静脈カニューレを通じて1.5〜3.0ミリリットル毎時の無菌生理食塩水を注入して再水分補給を開始します。鼻のコーンを使って麻酔を維持しつつ、呼吸や反射を監視してください。

頸静脈カニューレによる治療投与後、肝リンパを抗凝固液を含むチューブに継続的に集めます。収集チューブは毎時間または必要に応じて交換してください。頸動脈の血液サンプルは指定されたタイミングで採取し、末期サンプリング前に推定循環血量の10%未満に抑えること。

腹部切開部を再開して上腹部を露出させつつ、深麻酔と安定した呼吸を維持します。生理食塩水で湿らせたガーゼを使って、肝臓を横隔膜、左側の胃、そして下側の小腸へと優しく引き戻します。腸間膜リンパ管に隣接する肝リンパ管に平行に走る肝動脈を特定します。

外径0.61ミリメートル、内径0.28ミリメートルのポリビニールカニューレを抗凝固液で充填し、気泡を除去します。湾曲した虹彩鉗子を使い、肝動脈の短い区間を分離します。動脈の下に4-0シルク縫合糸を挿入します。

動脈を優しく持ち上げ、最初の先端に2本目の縫合糸を挿入します。遠位縫合糸は逆流を抑えるために結び、近位縫合糸は後で閉鎖できるように結ばずにおきます。細かい先端マイクロハサミを使い、縫合線の間の動脈壁に約0.5ミリメートルの小さな横切開を行います。

デュモン鉗子の先端を使って血管フラップを持ち上げ、カニューレ挿入のために血管の腔を安定させます。ポリビニールカニューレの面取り端を開口部に挿入し、カニューレを約2〜3ミリ進めます。血管とカニューレの両方に近位縫合糸を結んでカニューレを固定します。

鮮やかな赤色の動脈血を軽く吸引して正しい位置を確認しましょう。抗凝固剤を含むあらかじめラベル付きのチューブに0.5〜1ミリリットルの血液を採取します。胸部、肝臓、腸系膜リンパにおける静脈内投与の高分子治療薬のリンパ回復は、リンパ輸送評価におけるモデルの有用性を示しています。

肝リンパは胸および腸系膜リンパに比べて総脂質含有量が著しく低く、タンパク質濃度は他のリンパ源と同等です。このプロトコルにより、肝リンパと血液の同時測定を行い、薬物、栄養素、信号を含む分子の輸送、代謝、クリアランスを評価できます。肝リンパ管の正確なカニュレーションは技術的に難しく、慎重な解剖学的同定と手術技術が必要です。

今後の研究では、肝臓輸送、クリアランス、代謝のマッピングに活用され、肝疾患や標的治療の理解を深めることが期待できます。