振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

本研究では、行動中のマウスにおける虚血性脳卒中発生時のアストロサイトとニューロンの活動を同時に記録するための統合的な手法を開発しました。従来の手法では、ニューロンまたはアストロサイトのいずれかを個別に記録していました。本プロトコルでは、脳卒中発症の瞬間からアストロサイトとニューロンの信号を同時に捕捉することが可能です。

まず、深く麻酔をかけたC57BL/6Jマウスを、麻酔マスクを備えた脳定位固定装置に移動させます。フィードバック制御加熱パッドを用いてマウスの体温を36〜37.5°Cに維持しながら、10分ごとに麻酔深度を確認します。眼に眼軟膏を塗布した後、イヤーバーとマウスバーを用いてマウスを脳定位固定装置に固定します。

頭部を対称に固定した後、軽くプローブで触れて固定状態を確認します。除毛および皮膚の消毒を行い、外科用はさみを用いて正中線に切開を加えます。生理食塩水と綿棒で骨膜を清掃し、ブレグマとラムダを露出させます。

ガラス製マイクロピペットを下げ、ブレグマとラムダに順次接触させます。デジタルノギスでZ座標を確認した後、その差が0.04 millimeters未満になるまでマウスバーを調整します。再度ガラス製マイクロピペットを下げてブレグマに接触させ、デジタルノギスをゼロにリセットします。

マイクロピペットをブレグマから左右に2.3 mmずつ順に移動させます。Z座標を確認した後、左右の差が0.04 mm未満になるまでイヤーバーを調整します。デジタルノギスをブレグマでゼロにリセットし、前後方向+1.5 mm、内外方向+0.74 mmの位置に運動野前肢領域をマークします。

マイクロドリルと直径0.5 mmのラウンドチップドリルビットを使用し、印を付けた位置に直径約0.5 mmの小さな穴を開けます。注入前に、2種類の腺随伴ウイルスベクトルを等量で混合し、サンプルを短時間遠心分離します。マイクロインフュージョンポンプに接続したガラスマイクロピペットを、脳表面から背腹方向の深さ-0.94 mmにある標的部位まで降ろします。

各ベクター200 nanolitersを含むウイルスミックス400 nanolitersを、50 nanoliters/minuteの速度で注入します。注入完了の10分後に、ピペットをゆっくりと引き抜きます。頭皮を4-0 20 millimeter、3/8 circle縫合糸で縫合し、マウスが完全に回復するまでヒーティングパッドの上に置きます。

ウイルス注入後3〜4週間し、頭皮切開までの工程を既報の手順に従って行う。頭皮切開の際は、眼周囲に十分な皮膚を残しつつ、1.5 cm × 1.5 cmの頭皮を除去する。過酸化水素と0.9%生理食塩水で頭蓋骨を洗浄する。

ブレグマを確認した後、デジタルノギスの値をゼロにリセットします。0.8 mmのラウンドチップドリルを使用して、頭蓋骨表面を軽く粗くします。運動皮質の前肢領域をマークします。

前後の位置を1.5 mm、内側外側の位置を0.74 mmとします。この印を中心点として、5 mm × 5 mmの正方形を描きます。約10,000 rpmのマイクロドリルを使用して、正方形に沿って穿孔します。

ドリル経路に氷冷生理食塩水を絶えず供給し、骨片が緩んだ場合は直ちに停止します。対側半球および小脳に、直径0.5 millimeterの小さな穴を3か所開けます。これらの穴に頭蓋形成術用スクリューを植え込みます。

各スクリューが硬膜に達していることを確認し、脳組織への損傷を避けるため、それ以上に深く刺入させないようにしてください。ピンセットを使用して、緩んだ骨片を取り除きます。脳組織への直接的な接触を避けながら、頭蓋窓の硬膜を除去するために、先端が 0.03 mm × 0.01 mm 未満の超微細ピンセットを使用してください。

オプトロードを定位固定装置のマイクロマニピュレーターアームに固定し、頭蓋窓の上に移動させます。オプトロードの銀色の接地線と参照線を、3本の頭蓋形成術用ネジにしっかりと絡ませて固定します。滅菌生理食塩水で頭蓋窓の表面を清掃します。

optroを10秒間に1mmの速度で、目的の背腹方向の深さである-0.94mmまでゆっくりと下降させます。植え込み後、頭蓋窓の上にアガロース層を適用します。その後、歯科用セメントを3〜4層にわたって塗布します。

歯科用セメントが凝固した後、3〜5日間の鎮痛処置を行い、マウスを1〜2週間回復させます。2波長または3波長のファイバーフォトメトリシステムを使用してGCaMP6sを励起させます。シグナルチャンネルを470 nanometersに、コントロールチャンネルを410 nanometersに設定します。

サンプリングレートを60 frames per secondに調整します。次に、すべての記録システムコンポーネントを適切に接地してください。記録中は共通のメディアンリファレンスを使用します。

記録ソフトでワイドバンド信号および局所フィールド電位信号が選択されていることを確認し、記録セッションの間、ノイズのモニタリングを行ってください。マウスを短時間麻酔した後、アダプターを介してoptroを記録ラインに接続します。記録のため、マウスをホームケージに似た環境に配置してください。

覚醒後、10分間の順化時間を設けます。握力テストを行うマウスを記録し、5分間、1分につき1回の牽引を行います。行動テストのタイムスタンプは、マルチチャンネルシステムとファイバーフォトメトリーシステムの両方で正確に記録してください。

1.5%ローズベンガル染料溶液を10～20 mg/kgの用量で腹腔内投与し、5分間待機します。深い麻酔状態に達し、それが維持されていることを確認した後、オプトロードプローブをレーザー光源に接続します。埋め込まれたオプトロードを通じて、530 nmのレーザービームを15 mWで5～8分間照射し、局所虚血を誘発します。

光遺伝学的刺激を行うには、レーザースチミュレータをオプトロードに接続します。488ナノメートルの光遺伝学用レーザースチミュレータの電源を入れ、Opto-vTrap用に10ミリワットで5分間に設定します。最後に、マウスを保温パッドに置いて回復させます。

ベースラインと比較して、光血栓症後の脳血流量は低下し、脳卒中後1日および7日の時点でも抑制されたままであった。前肢の握力は、脳卒中後1日で非常に有意な低下を示し、7日後も抑制されたままであった。ファイバーフォトメトリーで記録されたアストロサイトのカルシウム・トランジェントと、電気生理学によるニューロンのスパイクは、タイムスタンプに基づいて同期させた。

光血栓性脳卒中後、前肢把握タスク中のベースライン時の発火と比較して、錐体ニューロンと介在ニューロンの両方で発火率が有意に抑制されました。ベースラインでは、アストロサイトのカルシウム過渡応答はタスク開始から4〜6秒以内にピークに達しました。しかし、光血栓性脳卒中後は振幅が有意に減少し、カルシウム活性の低下を反映していました。

ラスタープロットおよび刺激周囲時間ヒストグラムにより、光刺激中の神経活動の変化が示されました。錐体ニューロンと介在ニューロンの両方の発火率において、刺激前ベースラインと比較して光刺激後に有意な減少が認められ、アストロサイトの変調が局所回路の興奮性に測定可能なダウンストリーム効果を及ぼすことが確認されました。本プロトコルにより、急性期の発症から慢性期に至る脳卒中タイムライン全体にわたる、運動および神経活動の連続的な記録が可能となります。

本プロトコルの成功は、精密または協調的なアライメントにかかっています。単眼オプトロッドのインプラントと、手術全体を通じた十分なウイルス発現期間が必要です。今後の研究では、複数のインプラントを用いてより広範な脳領域をモニターしたり、多様な行動解析を用いて異なる細胞タイプを標的にしたりすることが考えられます。