生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

本研究は、同期振動性高血糖とパルサルせん断応力が糖尿病性血管疾患における内皮機能障害をどのように促進するかを調査します。既存のモデルでは、高血糖または定常層流が始動しています。私たちはパルサタイルせん断応力が振動性グルコース損傷にどのように対抗するかを調査します。

まず、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使ってマイクロ流体チップ構造を設計します。SU-8のマスターモールドは商業会社を通じて作成してください。きれいなミキシングカップで、ポリジメチルシロキサン硬化剤とプレポリマーを重量比10:1の比率で混ぜ、手で激しく5分間かき混ぜます。

その後、容器を真空チャンバーに0.08メガパスカルの圧力で少なくとも15分間置き、混合中に閉じ込められた気泡を取り除きます。ポリジメチルシロキサンをガラス製ペトリ皿に置いたウェハーに注ぎます。脱ガスは、鋳造中にできた気泡を除去するために、乾燥器でさらに15分間ウェハーに注ぎ込みました。

型とポリマーを入れたペトリ皿を80度の高温オーブンに2時間入れます。メスを使って、マスターモールドから固まったポリマースラブを慎重に剥がします。コアパンチツールを使い、ポリマースラブの指定されたチャネル端に入口と出口ポートを作成します。

ガラスカバーのスリップとポリマースラブの模様のある面を接着テープで拭き取ります。次に、ポリマースラブとガラスカバーのスリップをプラズマクリーナーで65ワットの室内空気下で60秒間処理します。すぐにポリマーチャンネルの面を処理済みのガラスカバースリップの面に合わせます。

その後、優しく押して永久に閉じたマイクロ流体チャネルを作ります。結合されたマイクロフルイディックチップを、脱イオン水を入れたホウ素化ガラス瓶に入れます。121度摂氏、15ポンド毎平方インチで20分間、オートクレーブで滅菌します。

滅菌したチップをPBSと低グルコースDMEMの等モル混合液を入れた60ミリの培養皿に入れます。次に1ミリリットルの注射器を使い、1ミリリットルあたり100マイクログラムのフィブロネクチンをチャネルに注入し、37度で4時間培養します。次に、低グルコースDMEMに24.5ミリモラーデマニトールを加え、浸透圧を上げます。

高グルコースDMEMに5ミリモラーD-グルコースを加え、最終濃度30ミリモールグルコースを得ます。通常のグルコース培養培地と高グルコース培養培地を準備し、20%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補足します。その後、37度の水浴で温めたPBS、トリプシン、正常グルコース培養培地、高グルコース培養培地を浸します。

培養皿からヒト臍帯静脈内皮細胞を90%の合流率で採取します。0.25%トリプシン-EDTA溶液で細胞を剥離します。細胞を37度Cで30秒間培養した後、採取した細胞を数え、1×10の6細胞毎ミリリットルの濃度で正常グルコースと高グルコース培地に別々に再懸浮させます。

1ミリリットルの注射器を使い、マイクロフルイディックチップの入口ポートに細胞懸濁液100マイクロリットルを注入し、対照群には正常グルコース培地、実験群には高グルコース培地を投与します。マイクロフルイドチップを37度の加湿インキュベーターに5%二酸化炭素で48時間入れます。提示された式を用いて、目標のパルサタイルせん断応力を達成するために必要な流量を計算します。

圧力源を圧力コントローラーに接続してください。その後、圧力コントローラーをコンピューターに接続したバルブコントローラーに接続し、圧力波形状の自動制御を行います。100ミリリットルのリザーバーを2つ満たします。1つは正常グルコース培養培地、もう1つは高グルコース培養培地です。

貯蔵槽を圧力コントローラーの対応するチャネルに接続します。次にリザーバーと2段階の3方向磁気バルブをシリコーンチューブで接続します。目標生理的パルサタイルせん断応力を約200マイクロリットル毎分の流量に設定します。

プログラム可能なエアポンプをプログラムし、パルサル性せん断応力を維持するために正弦波関数を生成します。次に、バルブコントローラーを5分ごとにチャンネルを切り替え、動的刺激中に方形波のグルコース振動を発生させるようにプログラムします。シリコーンチューブで2段階の3方向磁気バルブとマイクロフルイディックチップを接続します。

その後、プログラム可能なポンプシステムを起動してチューブをプライミングします。次に、直径1.3ミリの90度角度付きステンレス鋼コネクターを使い、マイクロ流体チップの入口と出口ポートをチューブに接続します。マイクロ流体チップの出口を廃棄物貯留槽に接続し、ポンプを再開して振動性グルコースとパルサタイルせん断応力を合計30分間供給します。

フローフィールド検証を行った後、実験エンドポイントの製造指示に従ってカルセインAMおよびプロピジウムヨウ化物の作動溶液を準備します。チャネルをPBSで一度洗浄したら、カルセインAMとヨウ化プロピジウムの作業液をチャネルに注入し、37度の温度で5%二酸化炭素と共に暗闇で30分間培養します。10倍対物レンズを備えた逆度蛍光顕微鏡で、染色細胞の蛍光画像を即座に撮影します。

10倍対物レンズを搭載した逆形蛍光顕微鏡で、染色細胞の蛍光画像を即座に撮影します。カルセインAMにはフルオレセインイソチオシアネートグリーンフィルターを使用し、プロピジウムヨウ化物にはテトラメチルホダミンまたはロダミンレッドフィルターを使用します。チャネルをPBSで3回フラッシュした後、生細胞酸化ストレス蛍光プローブ溶液をチャネル内に導入し、前述の方法で培養します。

チャネルをPBSで3回フラッシュして、未結合プローブを取り除きます。20倍対物レンズを通して、遠赤色フィルターを用いて蛍光画像を即座に撮影し、すべてのグループで同じ露出パラメータを維持します。取得したカルセインAMグリーンおよびプロピジウムヨウ化物赤画像をImageJで開いてください。

各チャンネルの閾値を手動で調整して蛍光信号と背景信号を区別します。細胞カウンターを使って蛍光細胞を定量化し、観察結果に基づいて最小細胞サイズを調整して、複数の視野にわたる生細胞数と死細胞数を算出します。各実験条件ごとにスプレッドシートソフトを使って生きた細胞の割合を計算します。

その後、統計解析ソフトを使って複数の視野にわたる平均と標準偏差を計算し、グループを比較します。選んだ画像をImageJにドラッグしてください。「分析」を選択し、「スケール設定」を選択して、顕微鏡のメタデータを使ってピクセルサイズをキャリブレーションします。

その後、「プロセス」を選択し、「背景を減算」を選択し、「背景を減算」を選択して画像全体から非特異的な均一背景信号を除去します。次に「画像」を選択し、「調整」→「しきい値」を選択して、しきい値スライダーを手動で調整し、細胞内活性酸素種の信号を定義します。測定値を設定するには、「分析」を選択し、「面積」と「平均」グレー値を含めるように「測定セット」を選択してください。

「分析」および「粒子解析」を選択して、観察されたセルサイズに基づいて最小セルサイズを決定し、セル単層ROI内で分割信号の平均強度を測定します。各実験条件の活性酸素種レベルを、チップごとにランダムに選ばれた少なくとも3つの視野から導き出された測定値の平均として報告してください。定量的な結果をデータ分析やグラフ作成ソフトに入力します。

分散の双方向解析を用いて実験群と対照群を比較し、Tukeyの事後検定(有意水準0.05)を用いて統計的有意性を決定します。ソフトウェアを使って解析を行い、標準偏差を表す誤差バー付きのプロットを作成してください。代表的な蛍光画像では、すべてのグループで生存可能な細胞が高く、パルサタイルせん断ストレス群の正常血糖および正常グルコースでは無視できるほどの細胞死が観察された一方、振動性グルコースおよび振動性グルコースではパルサタイルせん断ストレス群では死細胞数が目に見える増加を示しました。

定量解析の結果、振動性グルコース曝露は対照群と比較して細胞生存率の有意な低下をもたらし、振動性グルコース条件下でのパルサタイルせん断ストレスの適用は振動性グルコース単独と比べて有意に生存率を高めたことが示されました。通常のグルコース条件下では、細胞内活性酸素のレベルは低く、せん断ストレスを加えるとさらに減少しました。一方、振動性グルコース条件では赤色蛍光の強度が著しく増加し、活性酸素種の増加を示しました。

せん断ストレスを加えた後、振動性グルコース誘発の細胞内活性酸素種の増加は減少しました。定量分析により、せん断ストレスは正常なグルコース条件下で活性酸素のレベルを有意に低下させることが示されました。対照的に、振動性グルコース条件では、活性酸素種のレベルが正常グルコースと比べて有意に増加しました。

さらに、せん断応力は振動性グルコース条件下でも活性酸素種のレベルを有意に低下させました。このプロトコルにより、ROSレベルと細胞利用可能性を定量化し、振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力下での内皮機能障害を研究することが可能になります。この手順の後、NRF2経路やiNOSシグナル伝達などの分子解析を行い、内皮保護機構を核状化することができます。

将来の研究では、このシステムを用いて機械生物学的経路の探査、流動の形状を乱したり、平滑筋細胞の共培養を組み込むことができるでしょう。