生体哺乳類細胞および三次元細胞モデルにおける蛍光寿命イメージングの基礎としてのリボグロウプローブのin vitro 特性解析

我々の研究は、RNAの時空間ダイナミクスを調査するために、生細胞内でのRNAの可視化に焦点を当てています。Riboglowプラットフォームは、多細胞システムにおける定量的蛍光寿命イメージング顕微鏡法を使用し、健康および疾患の生物学的システムに適用可能です。まず、ビードにロードされたRiboglowプローブを持つRNAサンプルまたは細胞を入手します。

コンフォカルレーザー走査顕微鏡システムの電源を入れ、次に顕微鏡制御ユニットをオンにします。時間相関単一光子カウントベースの蛍光寿命イメージング顕微鏡法またはFLIMシステムの電源を入れ、レーザー結合ユニット、フォトマルチプライヤー検出器、イベントタイマーを含みます。NIS画像取得・分析ソフトウェアを開いた後、セットアップおよび設定ウィンドウの下で、PicoQuantを使用したAXを選択します。

ソフトウェアが起動したら、AX FLIMおよびFCSを選択します。蛍光寿命データ取得のために顕微鏡をセットアップするには、AXパッドセクションでGalvanoが選択されていることを確認します。平均値を1に設定し、ディウェルタイムを2に設定します。

レーザー電力セクションで、個々のレーザースライダーを3〜4%に下げます。すべてのレーザースライダーを1に設定します。20倍のレンズを選択した後、スキャンエリア設定で512×512を選択し、検出器をオンにします。データファイルパスを定義するには、コントローラーセクションの下部まで移動し、構成を選択します。

PicoQuantまたはFLIM FCSタブをクリックした後、ワークスペースパスの下で、右側のフォルダ記号を選択します。保存場所で、その日の実験用に新しいフォルダを作成し、構成ウィンドウを閉じます。ライブが選択され、画像取得ウィンドウが表示されたら、再びライブを選択して光子収集を一時停止します。

蛍光寿命イメージング顕微鏡法またはFLIMデータ収集ウィンドウをセットアップするには、ライブ画像ウィンドウを右クリックし、PicoQuantプラグインを選択します。減衰曲線の表示、時間トレース表示、FLIM統計の表示を有効にします。細胞実験のレーザー配置をセットアップするには、ページの上部右側にあるレーザーの横にある実験設定に移動します。

多チャンネル染料ボックスの隣にある追加をクリックした後、希望の染料を追加します。エキスパートモードを選択します。各発光スペクトルの検出器の割り当てを調整します。

重複する励起および発光スペクトルを異なる検出器にルーティングします。左パネルで、重複する励起および発光スペクトルを持つ染料間のクロストークを最小限に抑えるためにパス順序を調整します。新しいレーザー構成を保存して名前を付けた後、実験用に保存した構成を選択します。

ライブ取得ウィンドウを右クリックします。取得制御を選択し、次にXYZ概要を選択します。FLIM用にイメージング細胞培養皿をロードする前に、ライブ細胞核染色を追加し、ゆっくりと回転させてベンチ上で混ぜ、30秒間置きます。

イメージング皿を顕微鏡ステージに置きます。皿を顕微鏡ステージの左下隅に押し込みます。非空気レンズを使用する場合は、XYドリフトを防ぐためにサンプルをステージにテープで固定します。

4'6-ジアミジノ-2-フェニリンドールまたはDAPIチャネルに切り替えます。コントローラーノブを調整して、細胞核がフォーカスに来るようにします。必要に応じて、Z高さノブの感度を調整し、細胞が視界に現れない場合は、XY座標を調整します。

完全フォーカスシステムまたはPFS自動フォーカスを有効にするには、AXパネルの右側で、PFSボタンの横にある虫眼鏡を選択します。顕微鏡が自動的にZ高さを正規化した後、PFSボタンが点灯し、フォーカスが表示されていることを確認します。AX検出器を使用して、DAPIチャネルで希望の細胞を見つけます。

次にATO 590チャネルに切り替えて、ビードにロードされた細胞を効果的に識別します。セルが特定され、ダブルクリックで中心に設定されたら、AX FLIMおよびFCSに切り替えます。512×512が選択されていることを確認し、細胞に合わせてフレームサイズを調整するには、角をクリックしてドラッグします。

サイズ変更されたフレームが赤色になるまで待ちます。フレーム内を右クリックするか、フレームが緑色になるまでライブを選択して、調整を確認します。希望の値にキャプチャ数を調整した後、キャプチャを選択します。

新しいキャプチャウィンドウと画面の右側にあるキャプチャ進行ボックスを観察します。FLIM分析ソフトウェアを開いた後、正しいファイルパスに移動します。分析ソフトウェアウィンドウに自動的に取得が表示されることを確認します。

取得時にファイル名を変更します。キャプチャが完了したら、AX検出器に切り替えます。ライブを選択して新しい細胞を探します。

AX FLIMおよび蛍光相関分析またはFCSウィンドウのサイズを、より大きなまたは小さな細胞に合わせて必要に応じて調整します。3時間のイメージング期間中に新しい細胞を取得した後、作成されたsptwファイルをエクスポートします。FLIMデータ処理と分析を進めて、収集されたサンプルから蛍光寿命測定値を抽出します。

代表的な減衰曲線は、RNA Aタグの存在がin vitroで抽出された蛍光寿命を増加させたことを示しましたが、RNA Aタグのないサンプルは左側にシフトした減衰曲線を示し、平均寿命値が短いことを示しました。3xGlyでビードにロードされた細胞の細胞蛍光寿命は、5xGlyでロードされた細胞のそれよりも著しく低かったです。代表的な減衰曲線は、3xGlyでロードされた細胞が5xGlyでロードされた細胞と比較して左側にシフトした減衰曲線を示し、平均蛍光寿命値が低いことを示しました。

Riboglowプローブでロードされた細胞の核は、同じ細胞の細胞質よりも一貫して高い蛍光寿命を示しました。疑似色スケール取得ウィンドウ、減衰曲線、および抽出されたtau平均振幅値はすべて同じ蛍光寿命トレンドを示しました。このプロトコルにより、研究者は異なる生物学的文脈で蛍光分子の蛍光寿命を決定することができます。

研究者は、RNAリガンドの追加を含む、この手順に従って定量的データ分析を実行し、関心のある変数を評価できます。将来の研究では、Riboglow FLIMを疾患モデルに適用し、多重化機能を拡張し、生きている動物システム内でのRNAダイナミクスを追跡することができます。