Name: 大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHおよびアダプターLapBによるLpxC分解のin vitroアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHとアダプターLapBによるLpxC分解の蛍光アッセイ。プロテオリポソームを用いた高感度定量的in vitro法で、膜関連タンパク質分解の動態解析が可能です。

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<ol><li>Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+proteases%3A+ATP-fueled+machines+of+protein+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction.</a> Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).</li>
<li>Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%3A+A+class+of+chaperone-like+ATPases+associated+with+the+assembly%2C+operation%2C+and+disassembly+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes.</a> Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).</li>
<li>Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+substrate+denaturation+and+translocation+by+the+ClpxP+degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine.</a> Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).</li>
<li>Gur, E., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+misfolded+proteins+by+Lon%2C+a+AAA%2B+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease.</a> Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).</li>
<li>Ogura, T., Wilkinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+superfamily+ATPases%3A+Common+structure-diverse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function.</a> Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+FtsH+protein+is+a+prokaryotic+member+of+a+protein+family+of+putative+ATPases+involved+in+membrane+functions%2C+cell-cycle+control%2C+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+and+subcellular+localization+of+FtsH+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).</li>
<li>Ito, K., Akiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions%2C+mechanism+of+action%2C+and+regulation+of+FtsH+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).</li>
<li>Chai-Danino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-embedded+polar+residues+target+membrane+proteins+for+degradation+by+the+quality+control+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+trapping+of+ftsh+substrates+by+label-free+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics.</a> Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).</li>
<li>Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trapping+approach+reveals+novel+substrates+and+physiological+functions+of+the+essential+protease+ftsh+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).</li>
<li>Young, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envA+permeability+cell+division+gene+of+Escherichia+coli+encodes+the+second+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis%3A+UDP-3-o-%28r-3-hydroxymyristoyl%29-n-acetylglucosamine+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase.</a> J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+biosynthesis+of+major+membrane+components+through+regulated+degradation+of+the+committed+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis+by+the+AAA+protease+FtsH+%28HflB%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).</li>
<li>Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+requires+the+essential+LapB+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein.</a> J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).</li>
<li>Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YciM+is+an+essential+gene+required+for+regulation+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).</li>
<li>Nicolaes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+function+of+YciM%2C+a+heat+shock+membrane+protein+required+to+maintain+envelope+integrity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+LapB+%28yciM%29+in+regulating+Escherichia+coli+lipopolysaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).</li>
<li>Shu, S., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+FtsH+is+a+membrane-bound%2C+ATP-dependent+protease+that+degrades+the+heat-shock+transcription+factor+sigma%2832%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32).</a> EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).</li>
<li>Yang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-degradation+relationship+of+a+membrane+protein+mediated+by+the+universally+conserved+ATP-dependent+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH.</a> J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).</li>
<li>Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Asahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsH+recognizes+proteins+with+unfolded+structure+and+hydrolyzes+the+carboxyl+side+of+hydrophobic+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues.</a> J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).</li>
<li>Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+regulation+of+lysogenic+decision+in+bacteriophage+lambda%3A+Transmembrane+modulation+of+FtsH+%28HflB%29%2C+the+cII+degrading+protease%2C+by+HflKC+%28HflA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).</li>
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<table><tbody><tr><td>1.5 mL マイクロ遠心管</td><td>USA scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>200 nm ポリカーボネート膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 タンパク質ラベリングキット</td><td>Sigma</td><td>38371</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-8920</td><td>非極性ポリスチレン吸着剤</td></tr><tr><td>黒色 96ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>クンマシーブリリアントブルー R250</td><td>Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>フィルターサポート</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシリンジ</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610017</td><td></td></tr><tr><td>ガラステストチューブ</td><td>KIMBLE</td><td>45066-16150</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Avantor</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム四水和物</td><td>Sigma</td><td>228648</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75-002-436</td><td></td></tr><tr><td>ミニ押出機</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MLA-80 ローター</td><td>Beckman</td><td>367096</td><td>固定角ローター</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵マイクロ遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002559</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>American Bio</td><td>AB01920-00500</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>38400100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>567547</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-11201</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>SCILOGEX</td><td>SCI-V1000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>高解像度ゲル濾過カラム</td></tr><tr><td>卓上超遠心機</td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-XP</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>超遠心管</td><td>Beckman</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>超濾過カラム</td><td>Millipore</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 ミキサー</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>酢酸亜鉛二水和物</td><td>Sigma</td><td>379786</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

大腸菌の膜結合プロテアーゼftshおよびアダプターlapbによるlpxc分解のin vitroアッセイ

An In Vitro Assay For LpxC Degradation By The Membrane-Bound Protease FtsH And Adaptor LapB From Escherichia coli

大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHおよびアダプターLapBによるLpxC分解のin vitroアッセイ

This protocol presents a sensitive, quantitative in vitro degradation assay of LpxC using reconstituted AAA+ (ATPase associated with diverse cellular ...

E. coliは、LPSの分解を制御することでリポ多糖の合成を調節しています。本研究では、LPSのin vitro分解アッセイの確立に焦点を当てています。このプロトコルは、水溶性基質のFtsH介在性タンパク質分解を定量的に測定するために適用できます。まず、LpxCタンパク質を用意します。0.5 mgのタンパク質をpH 7.6の50 mMリン酸緩衝液で希釈し、最終容量を225 µLにします。1 M炭酸水素ナトリウムを25 µL加え、pHを約8.3に調整します。あらかじめ調製したAtto488ストック溶液2 µLを0.1 M炭酸水素ナトリウム緩衝液18 µLで希釈し、最終濃度0.0012 mg/µLのAtto488作業溶液を調製します。このAtto488作業溶液4 µLを、直ちにタンパク質溶液に加えます。チューブをアルミホイルで遮光し、4 °Cで緩やかに撹拌しながら2時間置きます。PD-10脱塩カラムを超純水10 mLで洗浄し、次に15 mLのリン酸緩衝液で平衡化します。標識反応混合物を平衡化したカラムに適用し、樹脂に完全に浸透させます。50 mMリン酸緩衝液5 mLをカラムに加え、LpxC--Atto488と遊離Atto488色素に対応する2つの明確に分離したバンドを確認します。最初のバンドから約0.5 mLずつフラクションを回収します。SDS-PAGEを用いて、溶出フラクションを分離します。クマシーブリリアントブルー（CBB）染色を行う前に、紫外線照射または蛍光イメージャーを用いて蛍光を可視化します。LpxC--Atto488を含むフラクションを回収し、まとめます。標識タンパク質を約2 mg/mLまで濃縮した後、NanoDropを用いてタンパク質およびAtto488の濃度を測定し、標識効率を推定します。LpxC--Atto488を1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。液体窒素で急冷した後、サンプルを-80 °Cで保存します。ドラフトチャンバー内で、クロロホルムに溶解した100 milligramsのPOPCをガラス試験管に移します。緩やかな窒素ガス流下で溶媒を蒸発させた後、真空状態で一晩乾燥させます。乾燥したPOPCフィルムに、20 millimolar Tris-hydrochloride（pH 7.5）および100 millimolar 塩化ナトリウムを含む1.315 millilitersのバッファーAを加えます。ウォーターバスによる超音波処理1分間と、最大速度でのボルテックス処理1分間を交互に、約15分間、または脂質が完全に分散するまで繰り返し、脂質を再懸濁させます。リポソーム懸濁液を200 microliterずつ分注します。200 µLのリポソーム分注液の1本に、800 µLのバッファーAを加えて希釈します。液体窒素と室温の水槽に交互に浸

an-vitro-assay-for-lpxc-degradation-membrane-bound-protease-ftsh

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学ぶ大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHとアダプターLapBによるLpxC分解の蛍光アッセイ。プロテオリポソームを用いた高感度定量的in vitro法で、膜関連タンパク質分解の動態解析が可能です。

大腸菌の膜結合プロテアーゼFtsHおよびアダプターLapBによるLpxC分解のin vitroアッセイ

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