大 腸菌 細胞侵入の定量および可視化のためのアミカシン保護アッセイ
July 3rd, 2026
従来侵襲性 大腸菌 株における抗生物質耐性は、従来のゲンタミシン保護アッセイを用いた細菌侵入の評価に課題をもたらしています。コロニー形成単位を列挙して細菌侵入を定量的に評価し、免疫蛍光共焦点顕微鏡による感染細胞の可視化による定性的評価方法を記述します。
我々は、付着する侵襲性大腸菌がどのように腸上皮細胞に侵入するかを特徴づけ、この過程に寄与する細菌因子の特定に焦点を当てています。ゲンタマイシン耐性分離株は従来の侵入アッセイを制限します。このアミカシンベースのプロトコルにより、細胞内細菌の正確な定量化が可能になります。
まず、侵入アッセイに必要なすべての試薬と培地を集めてください。次に、80度の冷凍庫から粘着性侵襲性エスカリシア・コリ(AIEC)株の凍結グリセロールストックを回収します。滅菌された木製の棒やピペットの先端を使い、茎から細菌を優しくこそげ取り、Luria-Bertani(LB)オーガープレートにストリークして単一コロニーを取得します。
プレートは37度の温度で一晩孵化します。翌日、滅菌された木製の棒やピペットの先端を使って、オーガープレートから単一のコロニーを摘み取ります。コロニーを3ミリリットルのLBブロスに接種し、37度で毎分200回転で一晩培養します。
次に、1晩の培養液を1ミリリットルのLBブロスに希釈して10回ずつ薄めます。分光光度計を用いて希釈した培養液の600ナノメートルでの光学密度を測定します。100マイクロリットルの夜間培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移し、遠心分離機で6,000Gで4度Cで10分間投与します。
細胞ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引し、ペレットを1ミリリットルの血清および抗生物質・抗菌剤フリーの培地に再懸浮させます。提供された式を用いて感染の倍数(MOI)を10にするために必要な細菌懸濁量を計算します。感染培地を準備するには、計算された細菌懸浮液の体積を無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離機管に移し、その体積を血清および抗生物質・抗菌剤フリーの培地で1ミリリットルに補います。
ピペットで上下に何度か優しく混ぜます。希釈した一晩中の細菌培養液の10倍の連続希釈を行い、無菌1X PBSで10倍の希釈を行い、1ミリリットあたりのコロニー形成単位を特定するために96ウェルプレートを準備します。薄めた一晩培養液200マイクロリットルをプレートの最初のウェルに移します。
培養液20マイクロリットルを次の1XPBS180マイクロリットル入りの列にピペット移液します。ピペットを上下に10回ずつ混ぜ、新しいピペットの先端で希釈を繰り返し、毎回10の6の乗まで繰り返します。次に、10マイクロリットルのスポット希釈を3倍に、10から2の乗から6の乗まで3倍にプレートします。
炎の近くでスポットがオーガーに吸収されるのを待ちます。盤を27〜30度で一晩培養し、コロニーの過剰増殖を防ぎ、明確な個々のコロニーを確保します。インキュベーターからコラーゲン被覆された24ウェル培養プレートで培養した健康な結合したCaco-2上皮細胞単分子層を除去し、各ウェルから完全な培地を吸引します。
各ウェルに1ミリリットルの血清と抗生物質・抗菌剤フリーの培地をピペットで注入します。培地の痕跡を除去するために吸引し、もう一度洗いを繰り返して合計2回洗います。次に、Caco-2細胞を含む24ウェルプレートの各ウェルに、AIECを含む事前に準備された感染培地1ミリリットルを加えます。
24ウェルプレートを室温で500Gで15分間遠心分離し、細菌と上皮単一層の接触を同期させ、37度の温度で5%二酸化炭素と3時間培養して細菌侵入を促します。抗生物質含有培地を、予温された血清および抗生物質・抗菌剤フリー培地に240マイクログラム/ミリリットルを加えて調製します。感染期間が終わった後、Caco-2細胞単分子層から培地を吸引し、それぞれのウェルを1ミリリットルの血清と抗生物質・抗菌剤フリーの培地で洗浄します。
メディアを吸引し、もう一度洗車を繰り返し、合計2回洗います。次に、各ウェルに240マイクログラム/ミリリットルのアミカシンを含む培地をピペット1ミリットル注入します。並行して、別の細胞群に100マイクログラム/ミリリットルのゲンタミシンを投与し、細胞を37度の温度で5%二酸化炭素と共に1時間培養して細胞外細菌を除去します。
孵化後、各井戸から培地を吸引します。付着した細菌を洗い流すためにPBSを1ミリリットル加えます。PBSを吸引し、もう一度洗車を繰り返し、合計2回洗います。
次に、各ウェルに1%トリトンX100をPBSで希釈した200マイクロリットルを加え、軌道シェーカーで毎分90回転で10分間培養して上皮細胞を溶解します。ピペットは1ウェルあたり約30回上下に動かして、セルをプレートから外します。次に、PBSを用いて96ウェルプレート上で細胞溶解液を10倍の連続希釈を行います。
未希釈から10マイクロリットルの3乗の3倍のスポット希釈をLBオーガープレートにプレートします。斑点が乾燥した後、27〜30度の温度で一晩培養し、透明な個々の菌株を得ます。培養後、プレートを取り出し、適切なスポット希釈から7個以上の菌落を含む十分に分離されたコロニーを三重体の各スポットに含みます。
最後に、方程式を用いて接種量と回収した菌落形成単位を1ミリリットルあたり、侵入率を計算します。侵襲性AIEC株NRG857cによるCaco-2細胞単層感染後、または非侵襲性大腸菌DH5α制御株による感染後にゲンタマイシンまたはアミカシンのいずれかで治療しても、同様の侵襲プロファイルが得られました。これらの発見は、アミカシンがゲンタマイシンと同様に細胞外細菌の除去に効果的であり、細胞内細菌負荷を正確に反映していることを示しました。
炎症性腸疾患患者から得られたゲンタミシン耐性臨床的エシェリキア大腸菌分離株をゲンタミシンで治療した結果、細菌の回復値は約21%から2,788%まで大きく変動しました。対照的に、アミカシン治療はすべての分離株で細菌の回復を劇的に減少させ、その効果を示し、より信頼性の高い侵入測定を可能にしました。このプロトコルにより、細胞内細菌の正確な定量化と上皮細胞内の細菌侵入の評価が可能となります。免疫蛍光顕微鏡などの追加手法を用いて、細菌侵入の検証や細胞内局在の検証が可能です。
今後の研究では、新規病原性因子の特定や、浸潤性大腸菌感染時に標的となる宿主経路の調査が期待できます。
Overview
This article presents an alternative amikacin-based protection assay for quantifying and visualizing epithelial cell invasion by adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) and other multidrug-resistant pathogens. The method addresses limitations of the traditional gentamicin protection assay, particularly in the context of antibiotic-resistant isolates from inflammatory bowel disease (IBD) patients.
Key Study Components
Area of Science
- Microbiology
- Cellular infection assays
- Pathogen diagnostics
Background
- Epithelial cell invasion is a hallmark of several enteric pathogens, including Salmonella, Shigella, and Vibrio.
- AIEC is an emerging pathogen implicated in IBD pathogenesis.
- AIEC strains lack classic virulence factors, complicating genetic identification.
- Phenotypic classification relies on cell invasion assays, traditionally using gentamicin.
Purpose of Study
- To develop a reliable assay for quantifying AIEC invasion in the context of rising antibiotic resistance.
- To provide a diagnostic tool for screening IBD patients for AIEC.
- To enable assessment of cell invasion by multidrug-resistant pathogens.
Methods Used
- Amikacin-based protection assay to kill extracellular bacteria while sparing intracellular bacteria.
- Quantification of invasion using colony-forming units (CFU) recovered post-infection.
- Calculation of percent invasion score for comparative analysis.
- Immunostaining and confocal microscopy for qualitative visualization of invaded epithelial cells.
Main Results
- The amikacin-based assay effectively quantifies and visualizes AIEC invasion of epithelial cells.
- Amikacin is effective against strains resistant to other aminoglycosides and remains extracellular to host cells.
- The assay provides both quantitative and qualitative data on bacterial invasiveness.
- It is suitable for use with multidrug-resistant isolates from IBD patients.
Conclusions
- The amikacin-based protection assay is a robust alternative to gentamicin-based methods for assessing epithelial cell invasion.
- This method enhances diagnostic capabilities for AIEC and other resistant pathogens in clinical and research settings.
- It serves as a proxy for evaluating pathogen virulence and pathogenicity.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantifying epithelial cell invasion by multidrug-resistant Escherichia coli is critical for target validation and mechanistic de-risking in infectious disease research. The amikacin protection assay enables reliable phenotypic classification and comparative analysis of invasive potential, especially in the context of antibiotic resistance. This capability supports translational continuity from discovery through preclinical pathogen characterization and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of bacterial invasion phenotypes in disease-relevant epithelial models.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing intracellular from extracellular pathogen populations.
- Facilitates comparative assessment of strain invasiveness for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative assay for evaluating cell invasion by antibiotic-resistant isolates.
- Delivers reproducible percent invasion scores using CFU quantification post-infection.
- Supports qualitative visualization of invaded cells via immunostaining and confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking invasion phenotype to pathogenicity in IBD and other diseases.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate strains or interventions based on invasion metrics.
- Offers continuity from in vitro discovery to preclinical infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The amikacin protection assay fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting both hypothesis testing and downstream screening of multidrug-resistant pathogens.
- Discovery Biology: Provides robust quantification of invasion as a proxy for virulence and mechanistic insight.
- Screening: Standardizes evaluation of strain invasiveness for high-throughput or comparative workflows.
- Analytics: Generates quantitative percent invasion scores and qualitative imaging outputs for cross-condition analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro invasion data to preclinical and clinical pathogen characterization.
- Enterprise Reuse: Adaptable for diverse enteric pathogens and multidrug-resistant isolates across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in invasion phenotypes and reduces ambiguity in pathogen classification.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and scalability for both research and diagnostic applications.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for pathogen-focused portfolios and supports capital-efficient screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains or interventions based on validated invasion metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture infection models and quantitative microbiology.
- Needs access to amikacin, CFU plating infrastructure, and confocal microscopy for qualitative analysis.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and readouts for reproducibility.
- Adaptable to various epithelial cell lines and multidrug-resistant pathogen isolates.
- Assay reliability may depend on antibiotic susceptibility profiles of clinical isolates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:29
Preparation of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) and Infection Media
2:43
Plating Input AIEC Inoculum for Pre-Infection Quantification
3:55
Infection of Caco-2 Epithelial Cell Monolayers with AIEC
5:03
Treatment with Amikacin and Recovery of Intracellular Bacteria
7:38
Results
8:49
Conclusion
