大 腸菌 細胞侵入の定量および可視化のためのアミカシン保護アッセイ
2026年7月3日
従来侵襲性 大腸菌 株における抗生物質耐性は、従来のゲンタミシン保護アッセイを用いた細菌侵入の評価に課題をもたらしています。コロニー形成単位を列挙して細菌侵入を定量的に評価し、免疫蛍光共焦点顕微鏡による感染細胞の可視化による定性的評価方法を記述します。
我々は、付着する侵襲性大腸菌がどのように腸上皮細胞に侵入するかを特徴づけ、この過程に寄与する細菌因子の特定に焦点を当てています。ゲンタマイシン耐性分離株は従来の侵入アッセイを制限します。このアミカシンベースのプロトコルにより、細胞内細菌の正確な定量化が可能になります。
まず、侵入アッセイに必要なすべての試薬と培地を集めてください。次に、80度の冷凍庫から粘着性侵襲性エスカリシア・コリ(AIEC)株の凍結グリセロールストックを回収します。滅菌された木製の棒やピペットの先端を使い、茎から細菌を優しくこそげ取り、Luria-Bertani(LB)オーガープレートにストリークして単一コロニーを取得します。
プレートは37度の温度で一晩孵化します。翌日、滅菌された木製の棒やピペットの先端を使って、オーガープレートから単一のコロニーを摘み取ります。コロニーを3ミリリットルのLBブロスに接種し、37度で毎分200回転で一晩培養します。
次に、1晩の培養液を1ミリリットルのLBブロスに希釈して10回ずつ薄めます。分光光度計を用いて希釈した培養液の600ナノメートルでの光学密度を測定します。100マイクロリットルの夜間培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移し、遠心分離機で6,000Gで4度Cで10分間投与します。
細胞ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引し、ペレットを1ミリリットルの血清および抗生物質・抗菌剤フリーの培地に再懸浮させます。提供された式を用いて感染の倍数(MOI)を10にするために必要な細菌懸濁量を計算します。感染培地を準備するには、計算された細菌懸浮液の体積を無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離機管に移し、その体積を血清および抗生物質・抗菌剤フリーの培地で1ミリリットルに補います。
ピペットで上下に何度か優しく混ぜます。希釈した一晩中の細菌培養液の10倍の連続希釈を行い、無菌1X PBSで10倍の希釈を行い、1ミリリットあたりのコロニー形成単位を特定するために96ウェルプレートを準備します。薄めた一晩培養液200マイクロリットルをプレートの最初のウェルに移します。
培養液20マイクロリットルを次の1XPBS180マイクロリットル入りの列にピペット移液します。ピペットを上下に10回ずつ混ぜ、新しいピペットの先端で希釈を繰り返し、毎回10の6の乗まで繰り返します。次に、10マイクロリットルのスポット希釈を3倍に、10から2の乗から6の乗まで3倍にプレートします。
炎の近くでスポットがオーガーに吸収されるのを待ちます。盤を27〜30度で一晩培養し、コロニーの過剰増殖を防ぎ、明確な個々のコロニーを確保します。インキュベーターからコラーゲン被覆された24ウェル培養プレートで培養した健康な結合したCaco-2上皮細胞単分子層を除去し、各ウェルから完全な培地を吸引します。
各ウェルに1ミリリットルの血清と抗生物質・抗菌剤フリーの培地をピペットで注入します。培地の痕跡を除去するために吸引し、もう一度洗いを繰り返して合計2回洗います。次に、Caco-2細胞を含む24ウェルプレートの各ウェルに、AIECを含む事前に準備された感染培地1ミリリットルを加えます。
24ウェルプレートを室温で500Gで15分間遠心分離し、細菌と上皮単一層の接触を同期させ、37度の温度で5%二酸化炭素と3時間培養して細菌侵入を促します。抗生物質含有培地を、予温された血清および抗生物質・抗菌剤フリー培地に240マイクログラム/ミリリットルを加えて調製します。感染期間が終わった後、Caco-2細胞単分子層から培地を吸引し、それぞれのウェルを1ミリリットルの血清と抗生物質・抗菌剤フリーの培地で洗浄します。
メディアを吸引し、もう一度洗車を繰り返し、合計2回洗います。次に、各ウェルに240マイクログラム/ミリリットルのアミカシンを含む培地をピペット1ミリットル注入します。並行して、別の細胞群に100マイクログラム/ミリリットルのゲンタミシンを投与し、細胞を37度の温度で5%二酸化炭素と共に1時間培養して細胞外細菌を除去します。
孵化後、各井戸から培地を吸引します。付着した細菌を洗い流すためにPBSを1ミリリットル加えます。PBSを吸引し、もう一度洗車を繰り返し、合計2回洗います。
次に、各ウェルに1%トリトンX100をPBSで希釈した200マイクロリットルを加え、軌道シェーカーで毎分90回転で10分間培養して上皮細胞を溶解します。ピペットは1ウェルあたり約30回上下に動かして、セルをプレートから外します。次に、PBSを用いて96ウェルプレート上で細胞溶解液を10倍の連続希釈を行います。
未希釈から10マイクロリットルの3乗の3倍のスポット希釈をLBオーガープレートにプレートします。斑点が乾燥した後、27〜30度の温度で一晩培養し、透明な個々の菌株を得ます。培養後、プレートを取り出し、適切なスポット希釈から7個以上の菌落を含む十分に分離されたコロニーを三重体の各スポットに含みます。
最後に、方程式を用いて接種量と回収した菌落形成単位を1ミリリットルあたり、侵入率を計算します。侵襲性AIEC株NRG857cによるCaco-2細胞単層感染後、または非侵襲性大腸菌DH5α制御株による感染後にゲンタマイシンまたはアミカシンのいずれかで治療しても、同様の侵襲プロファイルが得られました。これらの発見は、アミカシンがゲンタマイシンと同様に細胞外細菌の除去に効果的であり、細胞内細菌負荷を正確に反映していることを示しました。
炎症性腸疾患患者から得られたゲンタミシン耐性臨床的エシェリキア大腸菌分離株をゲンタミシンで治療した結果、細菌の回復値は約21%から2,788%まで大きく変動しました。対照的に、アミカシン治療はすべての分離株で細菌の回復を劇的に減少させ、その効果を示し、より信頼性の高い侵入測定を可能にしました。このプロトコルにより、細胞内細菌の正確な定量化と上皮細胞内の細菌侵入の評価が可能となります。免疫蛍光顕微鏡などの追加手法を用いて、細菌侵入の検証や細胞内局在の検証が可能です。
今後の研究では、新規病原性因子の特定や、浸潤性大腸菌感染時に標的となる宿主経路の調査が期待できます。
概要
本記事では、付着侵入性Escherichia coli (AIEC) およびその他の多剤耐性病原体による上皮細胞への侵入を定量化および可視化するための、アミカシンを用いた代替的なプロテクションアッセイを紹介します。本手法は、従来のジェンタマイシンプロテクションアッセイの限界、特に炎症性腸疾患 (IBD) 患者から分離された抗生物質耐性株を扱う際の課題を解決するものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 細胞感染アッセイ
- 病原体診断
背景
- 上皮細胞への侵入は、Salmonella、Shigella、Vibrioなどの多くの腸管病原体の特徴である。
- AIECは、IBDの病態生理に関与している新興の病原体である。
- AIEC株は古典的な毒性因子を欠いており、遺伝的な同定を困難にしている。
- 表現型による分類は細胞侵入アッセイに依存しており、伝統的にジェンタマイシンが用いられている。
研究目的
- 抗生物質耐性の増加という背景の中で、AIECの侵入を定量化するための信頼性の高いアッセイを開発すること。
- IBD患者におけるAIECスクリーニングのための診断ツールを提供すること。
- 多剤耐性病原体による細胞侵入の評価を可能にすること。
使用した手法
- 細胞外の細菌を死滅させ、細胞内の細菌を生存させるためのアミカシンを用いた保護アッセイ。
- 感染後に回収したコロニー形成単位（CFU）を用いた侵入数の定量化。
- 比較分析のための侵入率スコアの算出。
- 侵入した上皮細胞を定性的に視覚化するための免疫染色および共焦点顕微鏡観察。
主な結果
- アミカシンを用いたアッセイは、上皮細胞へのAIECの侵入を効果的に定量化し、可視化することができる。
- アミカシンは、他のアミノグリコシド系抗生物質に耐性を持つ菌株に対しても有効であり、宿主細胞の細胞外に留まる。
- 本アッセイにより、細菌の浸潤性に関する定量的および定性的なデータの両方を得ることができる。
- IBD患者から分離された多剤耐性株への適用に適している。
結論
- アミカシンを用いた保護アッセイは、上皮細胞への浸入を評価するための、ジェンタマイシンを用いた手法に代わる堅牢な代替法です。
- 本手法は、臨床および研究環境におけるAIECおよびその他の耐性病原体の診断能力を向上させます。
- 本手法は、病原体の毒性および病原性を評価するための代用指標として機能します。
よくある質問
産業界における重要性
多剤耐性Escherichia coliによる上皮細胞への侵入を定量化することは、感染症研究におけるターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングにおいて極めて重要です。アミカシン保護アッセイにより、特に抗生物質耐性の文脈において、侵入能の信頼性の高い表現型分類および比較分析が可能になります。この機能は、創薬から前臨床段階の病原体特性評価、そしてポートフォリオの優先順位付けに至るまでのトランスレーショナルな連続性を支えるものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連する上皮モデルにおいて、細菌の侵入表現型の機能的な検証が可能になります。
- 細胞内と細胞外の病原体集団を区別することで、メカニズムのデリスキング（リスク低減）をサポートします。
- 株の侵入性を比較評価し、標的の優先順位付けを容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 薬剤耐性分離株による細胞侵入を評価するための、標準化された定量的なアッセイを提供します。
- 感染後のCFU定量により、再現性のある侵入率（%）を算出します。
- 免疫染色および共焦点顕微鏡を用いて、侵入した細胞の定性的な可視化をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 浸潤表現型をIBD（炎症性腸疾患）およびその他の疾患の病原性と結びつけることで、トランスレーショナルバイオマーカー戦略に適合させます。
- 浸潤指標に基づき、候補株または介入法のリスク調整済み推進を可能にします。
- in vitroでの発見から前臨床感染モデルへの継続性を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
アミカシン保護アッセイは、初期の探索から前臨床段階までの連続的なプロセスに適合し、仮説検証と多剤耐性病原体のダウンストリームスクリーニングの両方をサポートします。
- 発見生物学： 毒性の代替指標としての浸潤の強力な定量化と、メカニズムに関する洞察を提供します。
- スクリーニング： ハイスループットまたは比較ワークフローに向けて、菌株の浸潤性の評価を標準化します。
- 分析： 条件間解析のための、定量的な浸潤率スコアおよび定性的なイメージング出力を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitro の浸潤データを、前臨床および臨床的な病原体特性評価へと結びつけます。
- 組織内での再利用： 研究プログラム全体を通じて、多様な腸管病原体や多剤耐性分離株に適応させることが可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 浸潤表現型の予測信頼性を高め、病原体分類における曖昧さを低減する。
- 運用的価値： 研究および診断の両アプリケーションにおいて、アッセイの再現性とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値： 病原体特化型ポートフォリオのゴー/ノーゴー判断に情報を与え、資本効率の高いスクリーニングを支援する。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの浸潤指標に基づき、リスク調整済みの菌株または介入策の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 細胞培養感染モデルおよび定量微生物学の専門知識が必要です。
- アミカシン、CFU平板培養設備、および定性的分析のための共焦点顕微鏡へのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、アッセイ条件と判定結果のチーム間標準化が求められます。
- さまざまな上皮細胞株および多剤耐性病原体分離株に適応可能です。
- アッセイの信頼性は、臨床分離株の抗生物質感受性プロファイルに依存する可能性があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:29
Preparation of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) and Infection Media
2:43
Plating Input AIEC Inoculum for Pre-Infection Quantification
3:55
Infection of Caco-2 Epithelial Cell Monolayers with AIEC
5:03
Treatment with Amikacin and Recovery of Intracellular Bacteria
7:38
Results
8:49
Conclusion
