Name: 化学抵抗性細胞に対するエピゲノム全域のCRISPR-Cas9ベースのノックアウトスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶエピゲノム全域CRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングにより、三陰性乳がん細胞におけるパクリタキセル耐性のエピジェネティック調節因子を同定する方法。このプロトコルは多剤耐性細胞系での研究を可能にする。

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	<li>Almansour, N. M. Triple-negative breast cancer: brief review about epidemiology, risk factors, signaling pathways, treatment and role of artificial intelligence. Front Mol Biosci. 9, 836417 (2022).</li>
	<li>Nedeljkovic, M., Damjanovic, A. Mechanisms of chemotherapy resistance in triple-negative breast cancer-how we can rise to the challenge. Cells. 8 (9), 957 (2019).</li>
	<li>Bianchini, G., Balko, J. M., Mayer, I. A., Sanders, M. E., Gianni, L. Triple-negative breast cancer: challenges and opportunities of a heterogeneous disease. Nat Rev Clin Oncol. 13 (11), 674&#8211;690 (2016).</li>
	<li>Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer drug resistance: an evolving paradigm. Nat Rev Cancer. 13 (10), 714&#8211;726 (2013).</li>
	<li>Flavahan, W. A., Gaskell, E., Bernstein, B. E. Epigenetic plasticity and the hallmarks of cancer. Science. 357 (6348), eaal2380 (2017).</li>
	<li>Beretta, G. L. et al. Novel insights into taxane pharmacology: update on drug resistance mechanisms, immunomodulation and drug delivery strategies. Drug Resist Updat. 81, 101223 (2025).</li>
	<li>Sajid, A., Rahman, H., Ambudkar, S. V. Advances in the structure, mechanism and targeting of chemoresistance-linked ABC transporters. Nat Rev Cancer. 23 (11), 762&#8211;779 (2023).</li>
	<li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting multidrug resistance in cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219&#8211;234 (2006).</li>
	<li>Robey, R. W. et al. Revisiting the role of ABC transporters in multidrug-resistant cancer. Nat Rev Cancer. 18 (7), 452&#8211;464 (2018).</li>
	<li>Chen, Z. et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: review of the past decade. Cancer Lett. 370 (1), 153&#8211;164 (2016).</li>
	<li>You, D., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Epigenetic regulation of multidrug resistance protein 1 and breast cancer resistance protein transporters by histone deacetylase inhibition. Drug Metab Dispos. 48 (6), 459&#8211;480 (2020).</li>
	<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat Rev Genet. 16 (5), 299&#8211;311 (2015).</li>
	<li>Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? User&#39;s guide to genetic screens. Nat Rev Genet. 19 (2), 67&#8211;80 (2018).</li>
	<li>Yedier-Bayram, O. et al. EPIKOL, chromatin-focused CRISPR/Cas9-based screening platform, to identify cancer-specific epigenetic vulnerabilities. Cell Death Dis. 13 (8), 710 (2022).</li>
	<li>Gottesman, M. M., Lavi, O., Hall, M. D., Gillet, J. P. Toward better understanding of the complexity of cancer drug resistance. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 85&#8211;102 (2016).</li>
	<li>Theile, D., Staffen, B., Weiss, J. ATP-binding cassette transporters as pitfalls in selection of transgenic cells. Anal Biochem. 399 (2), 246&#8211;250 (2010).</li>
	<li>Yedier-Bayram, O. et al. Chromatin-focused genetic and chemical screens identify BRPF1 as a targetable vulnerability in Taxol-resistant triple-negative breast cancer. Exp Mol Med. 57 (6), 1294&#8211;1307 (2025).</li>
	<li>Gokbayrak, B. et al. Identification of selective SWI/SNF dependencies in enzalutamide-resistant prostate cancer. Commun Biol. 8 (1), 169 (2025).</li>
	<li>Kala, E. Y. et al. Functional genomic screens reveal RBBP4 as key regulator of cell cycle progression in TMZ-resistant glioblastoma. bioRxiv. doi:10.1101/2025.05.09.653010 (2025).</li>
	<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. J Vis Exp. 151, e59780 (2019).</li>
	<li>Yuan, Y. et al. Genome-wide CRISPR screen for unveiling radiosensitive and radioresistant genes. J Vis Exp. 219, e67982 (2025).</li>
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	<li>Li, W. et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554 (2014).</li>
	<li>McDermott, M. et al. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: practical guide with case studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).</li>
	<li>Hart, T. et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515&#8211;1526 (2015).</li>
	<li>Meyers, R. M. et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nat Genet. 49 (12), 1779&#8211;1784 (2017).</li>
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```html
<table><tbody><tr><td>100 mmプレート</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>45 &micro;mフィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>96ウェル黒透明底プレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>CellTiter-Glo発光性細胞生存アッセイ用</td></tr><tr><td>ブラスチシジン</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>選択用</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo発光性細胞生存アッセイ</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>CellTiter-Glo発光性細胞生存アッセイ用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12栄養混合物</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td></td><td></td><td>Robert Weinberg（MIT、ボストン、USA）からの提供</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>Cas9-安定細胞株生成用</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>gRNAクローニング用バックボーン</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin組織キット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>ゲノムDNA抽出用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>gRNAクローニング用バックボーン</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール（PEG）-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>レンチウイルス濃縮用</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン、リニア（PEI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>プロタミン硫酸塩（PS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>レンチウイルス感染用</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr><tr><td>プホロマイシン</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>選択用</td></tr><tr><td>SUM159PT付着細胞</td><td></td><td></td><td>Robert Weinberg（MIT、ボストン、USA）からの提供</td></tr><tr><td>タキソール</td><td>パクリタキセル、Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>RES細胞生成および維持用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA（0.05%）</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ベラパミル</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>選択用</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>レンチウイルス生産用</td></tr></tbody></table>
```

化学抵抗性細胞に対するエピゲノム全域のcrispr-cas9ベースのノックアウトスクリーニング

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

化学抵抗性細胞に対するエピゲノム全域のCRISPR-Cas9ベースのノックアウトスクリーニング

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

CRISPRベースのスクリーニング手法を用いて、トリプルネガティブ乳がんにおける化学療法耐性を誘導するエピジェネティックなメカニズムを調査します。まず、提示された成分を添加したHam's F-12 Nutrient Mixを用い、96ウェル黒色透明底プレートに159 PT接着細胞を1ウェルあたり2 × 10³ cellsとなるように調整して播種します。細胞を37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーター内で16時間インキュベートします。次に、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解したTaxolストック溶液を調製します。細胞を処理するために、培養液を用いてTaxolを0.3 nanomolarから10 micromolarの範囲で段階希釈し、DMSOのみをビークルコントロールとして使用します。濃度を段階的に上げたTaxol溶液200 microlitersを、n=3で細胞に添加して処理します。プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で 72 時間静置します。薬剤処理から 72 時間後、ルミネッセンスベースの ATP 定量アッセイを用いて細胞生存率を評価します。マイクロプレートリーダーでルミネッセンスを測定し、結果を DMSO コントロール値で標準化します。次に、適切な統計ソフトを用いて、4パラメータロジスティック用量反応モデルによる非線形回帰を行い、10%および50%阻害濃度（IC10およびIC50）を算出します。薬剤耐性細胞の作製を開始するため、6ウェルプレートの各ウェルに159 PT細胞を2×10⁵個播種します。その後、37℃、5%二酸化炭素条件下で一晩インキュベートします。翌日、2 mLの培地に含まれる10%または50%の阻害濃度のTaxolで細胞を72時間処理します。細胞が現在の薬剤濃度に耐性を持つ場合は、2つのウェルに分割します。一方を新鮮な培地を用いたバックアップコントロールとして保持し、もう一方のウェルではTaxolの濃度を2倍にします。耐性細胞を樹立させる際は、対照としてDMSOを含む培地で親細胞を継代し、DMSOの量は対応するTaxol処理に含まれる量と一致するように調整してください。親細胞株と耐性細胞株の間で50%阻害濃度（IC₅₀）値に有意な差が認められるまで、3〜4週間ごとに細胞生存率を測定します。安定した耐性細胞は、用量漸増時に使用した最終Taxol濃度で維持してください。耐性細胞の特性解析のため、薬剤存在下でRNAシーケンシング、ウェスタンブロッティング、qPCR、および細胞生存率アッセイを行う。159 PT Taxol耐性細胞および親細胞を、96ウェル黒色透明底プレートに2 × 10³ cells/wellの密度で3連（triplicate）で播種する。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートする。すべての処理条件でTaxol濃度を一定に保ちながら、80 µMから1.25 µMまでの2倍連続希釈したverapamilで細胞を処理します。処理から72時間後、ルミネッセンスベースのATP定量アッセイを用いて細胞生存率を評価します。耐性細胞において感受性を回復させつつ、細胞生存率を維持できるverapamil濃度を決定します。ベラパミルと併用するピューロマイシンの濃度を決定するために、159 PTタキソール耐性細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり2×10³個の密度で播種します。プレートを37°C、5% CO2条件下で16時間インキュベートします。あらかじめ決定した濃度のベラパミルを含む培地を用いて、ピューロマイシンを40から0.625 µg/mLの範囲で2倍段階希釈して調製します。細胞をそれぞれのピューロマイシン希釈液で72時間処理します。生存率測定後、ベラパミル共存下で生存率を5%以下に低下させる最低のピューロマイシン濃度を決定します。次に、一部の159 PT Taxol耐性細胞を用いて、ウイルス力価および感染多重度（MOI）を算出します。目的の感染多重度（MOI）に基づき算出した量のCas9レンチウイルスを、8 µg/mLのプロタミン硫酸を含む培養液中の細胞に直接添加します。感染から16時間後、ウイルス含有培地を新鮮な培地に交換します。翌日、培養液をあらかじめ決定した濃度のブラスチサイジン含有培地に交換し、ブラスチサイジンによる選択を行います。非感染細胞が排除されるまで選択を継続します。必須遺伝子に対するコントロールシングルガイドRNAを用いてCas9活性を検証するか、あるいはGFPをレポーターとして用いてノックアウト効率を評価してください。提示された方程式を用いて、目的のライブラリーカバレッジに到達するために必要な感染成功細胞数を算出します。各生物学的レプリケートに対して、独立した感染混合液を調製します。あらかじめ計算した細胞を播種した後、8 µg/mLのプロタミン硫酸を含む8 mLの完全培地を用いて、規定量のウイルス量で感染させます。16時間後、ウイルス含有培地を新鮮な培地と交換し、37 °C、5% CO2条件下で細胞をインキュベートします。事前に決定した濃度のベラパミル存在下でピューロマイシン選択を行い、一部の159 PT Taxol耐性細胞においてsg-RNA感染細胞を濃縮させます。非感染コントロールプレートのすべての細胞が死滅するまで選択を継続してください。通常、約3日間かかります。ピューロマイシンおよびベラパミルによる選択完了後、細胞をトリプシン処理し、導入時に決定したカバレッジレベルに対応する各生物学的レプリケートから、初期時点（タイムゼロ）の細胞ペレットを回収します。カバレッジを維持したまま、細胞を実験群に分割します。一方の群はDMSOを用いたコントロールとします。そして、もう一方をTaxol処理群とします。14〜16回の細胞分裂（population doublings）が行われるまで培養を維持してください。指定された計算式を用いて、細胞分裂回数を算出します。継代ごとに、細胞の生存率と増殖キネティクスをモニタリングしてください。ボトルネックを避けるため、十分な細胞数を維持します。目的の細胞分裂回数（ポピュレーション・ダブリング・レベル）に達したら、ペレットあたりのライブラリカバレッジを維持しながら、各レプリケートおよび条件について最終タイムポイントのペレットを回収します。後続のゲノムDNA抽出まで、ペレットを-80°Cで保存します。Taxol処理にかかわらず、耐性細胞は増殖し続けましたが、親細胞は同処理下で生存できませんでした。RNAシーケンシングにより、耐性細胞において最も発現が上昇している遺伝子の一つがABCB1であることが特定され、次いでABCB4やABCA5を含む他のABCトランスポーターが続きました。耐性細胞におけるABCB1発現の上昇は、定量PCRによって検証されました。Taxol耐性細胞は、多剤耐性表現型およびドキソルビシンおよびビンクリスチンに対する耐性を示しました。ピューロマイシンはABCB1介在性の薬剤排出を通じて細胞外へ排出される可能性があるため、耐性細胞におけるピューロマイシン選択は効率的ではない可能性があります。ベラパミル単独では細胞生存率に影響しませんでした。しかし、化学療法剤と併用すると、ベラパミルはこれらの薬剤に対する感受性を回復させました。また、非毒性量のベラパミルにより、Taxol耐性細胞においてピューロマイシン感受性が回復しました。DMSO処理群またはTaxol処理群の最終タイムポイントのサンプルを初期タイムポイントと比較したところ、ほぼすべての必須遺伝子がノックアウトによって枯渇しており、スクリーンの品質が確認された。対照的に、DMSO処理群とTaxol処理群のエンドポイントサンプルを比較しても、必須遺伝子は両群で必須のままであるため、枯渇は見られなかった。その代わりに、この比較によってTaxol感受性を高めるエピジェネティック修飾因子が明らかになった。Taxol耐性細胞を用いて実施されたEPIKOLスクリーンにおいて、複数のポジティブコントロール遺伝子およびエピジェネティック修飾因子が有意に枯渇しました。ABCB1を標的とするシングルガイドRNAは、Taxol処理群で特異的に枯渇しており、本スクリーンにおけるTaxol感受性のポジティブコントロールとしてABCB1が確認されました。本プロトコルにより、研究者はCRISPRスクリーニングプラットフォームを用いて、がんモデルにおける治療耐性を研究し、化学療法耐性のエピジェネティック調節因子を同定することが可能になります。化学療法耐性細胞のスクリーニングにおいて最も重要な検討事項は、ライブラリの代表性を維持し、導入および選択条件を最適化することです。今後の研究では、多剤耐性がん細胞の治療的脆弱性を特定し、化学療法耐性を克服するための新たな併用アプローチを開発します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

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レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

この記事では、健康なドナーキメラ抗原受容体T細胞におけるゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するための消耗に対する in vitro モデルの適用に関するプロトコルについて説明しています。...

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CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

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がん細胞のノンコーディングRNA間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルCRISPR干渉戦略

ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。...

放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

学ぶエピゲノム全域CRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングにより、三陰性乳がん細胞におけるパクリタキセル耐性のエピジェネティック調節因子を同定する方法。このプロトコルは多剤耐性細胞系での研究を可能にする。

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