Name: 肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ 肝腫瘍細胞の有糸分裂中における脂質滴の動態を蛍光顕微鏡で可視化する手法。細胞周期同期化と蛍光染色を組み合わせ、細胞小器官の動態と代謝調節を研究するための信頼性の高いプロトコルを提供します。

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<ol><li>Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitotic+kinases+in+coupling+the+centrosome+cycle+with+the+assembly+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).</li>
<li>Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AURKA+and+PLK1+in+mitotic+entry+and+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly.</a> Front Oncol. 5, 283(2015).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+Cyclin+B1-CDK1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).</li>
<li>Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1+controls+the+NEK2A-PP1%CE%B3+antagonism+in+centrosome+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction.</a> Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).</li>
<li>Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+phosphorylation+of+dynamin-related+GTPase+DRP1+participates+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission.</a> J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Makiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+acetyl-C16-ceramide-NBD+with+long-term+stability+and+no+cytotoxicity+into+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex.</a> Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).</li>
<li>Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+phosphorylation+of+GRASP65+during+mitotic+Golgi+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly.</a> Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+ste20-type+kinase+TAOK1+confers+protection+against+hepatocellular+lipotoxicity+through+metabolic+rewiring%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Commun%22%5BJournal%5D)">Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring.</a> Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).</li>
<li>Makishima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+induce+formation+of+cholesterol+ester-rich+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets.</a> PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).</li>
<li>Krahmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+correlation+profiles+identify+lipid+droplet+proteins+with+high+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+regulates+intracellular+distribution+of+adipose+differentiation-related+protein+during+triacylglycerol+accumulation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver.</a> J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).</li>
<li>Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipins%3A+A+diversity+of+intracellular+lipid+droplet+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins.</a> Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).</li>
<li>Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+contact+sites+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet contact sites in health and disease.</a> Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).</li>
<li>Krahmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+proteomics+and+phospho-proteomics+reveal+subcellular+reorganization+in+diet-induced+hepatic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis.</a> Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).</li>
<li>Ramosaj, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+availability+affects+neural+stem%2Fprogenitor+cell+metabolism+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation.</a> Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).</li>
<li>Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets%3A+Platforms+with+multiple+functions+in+cancer+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks.</a> Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).</li>
<li>Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+lipid+droplet+biology%3A+Getting+to+the+root+of+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver.</a> Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).</li>
<li>Minami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+lipophagy+ameliorates+nonalcoholic+steatohepatitis+through+extracellular+lipid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion.</a> Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).</li>
<li>Makiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+intracellular+lipid+droplets+during+cell+division+in+Huh7+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).</li>
<li>Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-taxilin+temporally+regulates+centrosome+disjunction+in+a+NEK2A-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner.</a> Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).</li>
<li>Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+formation+is+spatiotemporally+regulated+in+oocytes+during+follicular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice.</a> J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).</li>
<li>Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+protocol+is+critical+for+the+immunolabeling+of+lipid+droplet+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins.</a> Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).</li>
<li>Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nima-related+kinase+2+%28NEK2%29%2C+a+cell-cycle-regulated+protein+kinase+localized+to+centrosomes%2C+is+complexed+to+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1.</a> Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).</li>
<li>O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+regulation+by+nima-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Mitotic regulation by nima-related kinases.</a> Cell Div. 2, 25(2007).</li>
<li>Xie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDT-28%2FPLIN-1+mediates+lipid+droplet-microtubule+interaction+via+DLC-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td>細胞解離</td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>35 mm 組織培養ディッシュ</td><td>IWAKI</td><td>3000-035</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>6 cm 組織培養ディッシュ</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Anti-PLIN2 (ADRP) 抗体</td><td>Proteintech</td><td>15294-1-AP</td><td>脂滴マーカー</td></tr><tr><td>Anti-PLIN3 (TIP47) 抗体</td><td>Proteintech</td><td>10694-1-AP</td><td>脂滴マーカー</td></tr><tr><td>Anti-α-チューブリン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6199</td><td>有糸分裂紡錘マーカー</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>中性脂質染色</td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター（0.22 μm）</td><td>NEST</td><td>WNB343001</td><td>OA–BSA溶液の滅菌濾過</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>クリアネイルポリッシュ</td><td>市販</td><td>該当なし</td><td>カバースリップのシーリング</td></tr><tr><td>コンフォカル顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1200</td><td>高解像度イメージング</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ドジンド</td><td>340-07971</td><td>核染色</td></tr><tr><td>D-PBS（–）</td><td>Wako</td><td>049-29793</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Dulbeccoの改良Eagle培地（DMEM）</td><td>Wako</td><td>041-30081</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>エタノール（99.5%）</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>オレイン酸の溶媒</td></tr><tr><td>脂肪酸フリーBSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>オレイン酸のキャリアタンパク質</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>蛍光二次抗体（Alexa Fluor結合）</td><td>市販</td><td>該当なし</td><td>種特異的な蛍光免疫染色用二次抗体</td></tr><tr><td>FV10-ASWソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>該当なし</td><td>画像取得と処理</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ（φ15 mm）</td><td>松波</td><td>2-176-03</td><td>顕微鏡用細胞播種</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>松波</td><td>SFF-001</td><td>カバースリップを載せるためのガラススライド</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド（25%溶液）</td><td>Wako</td><td>073-00536</td><td>PLIN3の代替固定</td></tr><tr><td>HuH7細胞</td><td>JCRB細胞バンク</td><td>JCRB0403</td><td>ヒト肝腫瘍細胞株</td></tr><tr><td>LipidTOX Red中性脂質染色</td><td>Invitrogen</td><td>H34476</td><td>代替脂滴染色</td></tr><tr><td>窒素ガス（N2）</td><td>市販</td><td>該当なし</td><td>エタノールの蒸発</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1383</td><td>オレイン酸-BSA複合体の調製に</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、PBSに4%</td><td>中外テスク</td><td>09154-85</td><td>固定</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（×10）</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td>任意のベンダーに置き換え可能</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0569</td><td>G2/M同期のためのCDK1阻害剤</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>S36963</td><td>実装媒体</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl）</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>150 mM NaClの調製に</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム（NaOH）</td><td>Wako</td><td>080-01061</td><td>オレイン酸の石鹸化に使用</td></tr><tr><td>Tali細胞分析スライド</td><td>Thermo</td><td>T10794</td><td>細胞周期分析に使用</td></tr><tr><td>Taliイメージベースサイトメーター</td><td>Thermo</td><td>該当なし</td><td>細胞周期分析に使用</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞透過</td></tr><tr><td>ワイドフィールド蛍光顕微鏡</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td>有糸分裂細胞の迅速なスクリーニング</td></tr></tbody></table>

肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法

A Fluorescence-Based Method To Visualize Lipid Droplet And Organelle Dynamics During Mitosis in Hepatoma Cells

RO-3306を用いたG2/M境界における肝細胞の同期
有糸分裂中の細胞小器官の動態を調べるために、選択的CDK1阻害剤RO-3306を用いてG2/M境界20,21で細胞を同期させました。CDK1阻害剤で20時間処理した後、さらに新鮮培地で1時間処理した細胞では、50%以上の細胞がG2/M境界で同期しました(図1)。RO-3306を除去することで、細胞は細胞周期に入ることが許されます。試薬を洗い流す前、HuH7細胞は上皮細胞のような形態を示しました(図2)。RO-3306を洗い流してから1時間後、有糸分裂細胞は円形の形態を示し、部分的に皿から切り離されていたため、後の解析で同定が容易になりました(図2)。
<p class="jove_conten...

Intracellular lipid droplets (LDs) are ubiquitous in several cell types. LDs store neutral lipids such as triacylglycerol and cholesteryl ester and play ...

a-fluorescence-based-method-to-visualize-lipid-droplet-organelle

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP...

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

このプロトコルは、脂肪酸による刺激時のヒト腸内オルガノイドにおける脂質液滴(LD)形成の特性評価に関するアッセイについて説明する。このアッセイがLD形成の定量にどのように使用され、LD形成に影響を与える薬剤の高スループットスクリーニングにどのように使用できるかについて議論する。...

ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ

マイトファジーは、ミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムです。しかしながら、 in vivoでの マイトファジーの評価は、信頼できる定量アッセイの欠如によって妨げられている。ここでは、細胞透過性の緑色蛍光ミトコンドリア色素と赤色蛍光リソソーム色素を使用して、生細胞内のマイトファジーを観察するためのプロトコルを紹介します。...

ミトコンドリアとリソソームの蛍光色素によるマイトファジーの可視化

ここでは、肝臓組織における脂肪滴の特性評価に最適化されたBODIPY...

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

本プロトコルでは、オイルレッドOを使用して脂肪滴(LD)を染色する方法、脂肪酸誘発脂肪肝細胞モデルでLDのサイズと数を計算する方法、およびBODIPY...

ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。...

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

脂肪食は、脂肪滴の分解を伴うオートファジーの選択的な形態です。このプロセスの機能不全は、がんの発症に関連しています。しかし、その正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。このプロトコルでは、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行の相互作用をよりよく理解するための定量的イメージングアプローチについて説明します。...

脂肪食法による脂質飛沫異化作用の制御の探索

GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ-...

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

のHi - Cのメソッドは、クロマチンの相互作用（1）の公平な、ゲノムワイドな同定が可能になります。のHi -...

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

学ぶ 肝腫瘍細胞の有糸分裂中における脂質滴の動態を蛍光顕微鏡で可視化する手法。細胞周期同期化と蛍光染色を組み合わせ、細胞小器官の動態と代謝調節を研究するための信頼性の高いプロトコルを提供します。

肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法

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