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<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes Axygen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate Falcon polystyrene microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, 60%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 30%&nbsp; and bis-acrylamide solution, 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610157</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum fold</td><td>Reynolds&nbsp;</td><td>U07211R0</td><td></td></tr><tr><td>Amonium Persulfate (APS)</td><td>Merck</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Binocular stereomicroscope</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>&nbsp;A9418</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DelltaVision microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 &mu;m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific/Nalgene</td><td>09-740-63B</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps FST Dumont SS</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed&nbsp; anti-rat labelled by AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11073</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Merck</td><td>Z412392</td><td></td></tr><tr><td>Growing chambers / greenhouse / or field</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Masking tape 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-047-259</td><td></td></tr><tr><td>Maize seeds</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-H coverslips&nbsp;</td><td>Deckgl&auml;ser, Zeiss</td><td>474030-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide box</td><td>Fisher Scientific,</td><td>03-448-9</td><td></td></tr><tr><td>Micropipets P20, P200, P1000</td><td>Merck</td><td>CLS4069</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>Merck</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Grade</td><td>&nbsp;15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic box with lid</td><td>Tupperware</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifading</td><td>Molecular Probes</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish regular size</td><td>Merck</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (0.5-10 uL) sterile&nbsp;</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT300</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (200 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT200Y&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (1000 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT1000BRS</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade - single edged</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform shaker</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Merck</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Merck</td><td>S8143</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure Acrylamide</td><td>Invitrogen</td><td>15512023</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

トウモロコシ減数細胞における三次元免疫局在化

Three-Dimensional Immunolocalization In Maize Meiocytes

During meiotic prophase I, the physical configuration of chromosomes varies widely across developmental stages, fortunately these stage-specific ...

本研究では、トウモロコシの雄性減数分裂細胞を研究し、単一細胞内で減数分裂タンパク質を可視化するための3Dアプローチの開発に焦点を当てています。このプロトコールは、トウモロコシ以外にも、イネ、ライムギ、オオムギ、コムギの減数分裂細胞の研究に適用可能です。まず、花序がまだ茎の中で成長しているV13段階のトウモロコシ植物を用意します。減数分裂期の葯を固定する週に、手袋を着用して、肥大した茎の膨らみ部分を軽く押し、切り開くのに十分な柔らかさであるかを確認します。必要な緩衝液を調製した後、プラスチックボックスの中に加湿したペーパータオルを5〜10枚入れて、湿潤チャンバーを準備します。チャンバー内の余分な水を取り除いてください。カミソリを用いて、花序レベルで茎を切り開き、雄穂の分枝および側枝を露出させます。側枝を切り出して回収した後、チャンバーを室温に保ったまま、湿潤チャンバー用のタオルで側枝を包みます。実体顕微鏡を用いて、小花から新鮮な葯を回収し、2 mLの1X buffer AまたはBAを入れた35 mmのペトリ皿に入れます。大きさおよび色に基づいて、有糸分裂のステージを判定します。葯を新しい35 millimeterのペトリ皿に移した後、3 millilitersの固定液を葯に加えます。ホルムアルデヒドの蒸発を防ぐため、ペトリ皿をパラフィルムで密封します。35 millimeterのペトリ皿を、ロータリーシェーカー上に配置した大きめのペトリ皿に乗せ、室温、40 to 60 RPMで45分間振とうします。葯を3 mLの1 XBAで洗浄します。葯を小型のペトリ皿に移した後、ペトリ皿を密閉し、室温で速度を40～60 RPMに設定した回転振盪機に45分間置きます。清潔なピンセットを使用して、葯を3 mLの1 XBAが入った小型の35 mmペトリ皿に移します。ペトリ皿をパラフィルムで密に密封した後、小さなペトリ皿をより大きなペトリ皿の中に入れます。アルミ箔で覆い、使用時までサンプルを4 °Cで保存します。1日目に、アクリルアミドと2 XBAを等量ずつ混合し、2 mLのアクリルアミド溶液を調製します。亜硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムを加える前に、アクリルアミド溶液を真空下で5〜10分間脱気します。準備したスライドの数に合わせて、アクリルアミドと2 XBAを1:1で混合した溶液を100 µLずつ1.5 mLチューブに分注します。2 cm × 2 cmのパラフィルムの断片をシャーレの上に置き、実体顕微鏡の下に配置します。ハサミでピペットチップをカットした後、葯を含むBA溶液を50 µL、パラフィルム上にピペットで滴下します。別の箇所にBA溶液を25 µL滴下します。ピンセットで葯を固定し、メスを用いて先端を切り取ります。減数分裂細胞を絞り出した後、ピペットを用いてそれらを25 µLのBA液滴に移し、静かに混ぜ合わせます。減数分裂細胞の混合液10 µLを別のカバーガラス上に分注します。アクリルアミドと2X BAを含む1.5 mLチューブに、亜硫酸ナトリウム5 µLと過硫酸アンモニウム5 µLを迅速に加えます。この混合液を5 µLピペッティングしてカバーガラス上に滴下し、メイオサイトと混合させます。ポリリシンコートされたカバーガラスを45度の角度で上に載せます。室温で30〜50分間静置して完全に重合させた後、カミソリを用いて慎重にカバーガラスを分離させます。次に、パッド面を上にしてペトリ皿に配置します。室温で、1 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と1% Tritonを添加した1X PBS 1 mLを用いて、カバーガラスを2時間洗浄します。検出時に異なるシグナルを確実に得られるよう、異なるホスト種由来の一次抗体を調製し、混合します。希釈した一次抗体 50 µL を、パッドが載ったカバーガラスの中央に加えてください。その後、ペトリ皿を加湿チャンバーに入れ、一晩静置します。2日目に、1× PBS、0.1% Tween 20、および 1 mM EDTA を含む洗浄バッファー 500 mL を調製します。ピペットを使用して、一晩反応させた溶液を除去します。カバースリップを1 mLの洗浄緩衝液で2回洗浄します。緩衝液を除去した後、再び1 mLの洗浄緩衝液を加え、室温で1時間インキュベートします。この洗浄ステップをさらに7回繰り返します。最後の洗浄後、ディッシュに蓋をして加湿チャンバー内で一晩静置します。ブロッキングバッファーを用いて、二次抗体を50倍に希釈して準備します。洗浄液を除去した後、希釈した二次抗体50 µLを各パッドの中央に加えます。次に、ペトリ皿を湿潤チャンバーに入れ、室温で2時間置きます。ウェルから溶液を除去した後、1 mLの洗浄バッファーを用いて、室温で1時間ずつ4回洗浄します。ウェルを1 mLのPBSで10分間洗浄し、この工程をさらに2回繰り返します。最終濃度を1 µg/mLに調製したDAPIを500 µLウェルに添加し、室温で30分間インキュベートします。4 °Cで保存されていたプロロングドゴールドを取り出し、室温になるまで融解させます。スライドを1 mLのPBSで30分間洗浄し、これを2回繰り返します。最後の洗浄液を除去した後、パッドの中央にProlonged抗退色剤を2滴滴下します。ウェルからカバーガラスを持ち上げ、ラベルを貼ったスライドの上に封入します。真空吸引を用いてカバースリップの端から余分なグリセロールを除去し、ネイルポリッシュを2度塗りして封印します。適切な励起波長とフィルターを用いて顕微鏡下でスライドを観察し、画像をキャプチャします。DAPI染色により、明瞭な核およびクロマチンの染色とともに、プラスチドおよびミトコンドリアDNAのより淡い天然の細胞質染色が認められました。前レプチネマ期において、first division oneまたはAFD1、asynaptic oneまたはASY1、およびZipper1またはZYP1が染色体上および細胞質に局在している。その後、信号は染色体上に集中したが、完全な接合が起こるまで相当量のZYP1が細胞質に留まっていた。減数分裂コヒーシンであるAFD1は、ジゴネマ期に入って初めて線状構造を形成した。接合複合体の線状フィラメントの形成と同時に、ZYP1およびAFD1が線状構造に組み込まれた後、ASY1のシグナルは相対的に弱くなりました。本プロトコルにより、研究者はタンパク質の共局在とダイナミクス、本来の細胞内局在、3D染色体構造、減数分裂の進行およびステージングを解析することが可能です。このプロトコルの主な課題は、一次抗体と二次抗体の適合する組み合わせを慎重に選択することです。本研究に基づき、雄と雌の減数分裂を比較することで、athelchasmiの根底にある分子メカニズムを調査する研究へと発展させることができます。

three-dimensional-immunolocalization-in-maize-meiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。...

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ...

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

アグロバクテリウムベースの注射(アグロインジェクション)プロトコルは、トウモロコシの苗木にフォックステールモザイクウイルスとサトウキビモザイクウイルスクローンを接種するために提示されています。このようにして接種すると、ウイルス感染、マーカー遺伝子のウイルス誘発遺伝子サイレンシング、およびGFPのウイルス過剰発現がもたらされる。...

組換えフォックステールモザイクウイルスおよびサトウキビモザイクウイルス感染性クローンの注射によるトウモロコシ苗木の直接農業接種

トウモロコシの葉の原基は深く覆われて転がされているため、研究が困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。...

蛍光および共焦点イメージングのためのトウモロコシ葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための改善された方法

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

減数分裂前期の染色体移動は、胞子形成の基本であるあまり理解されていない現象です。このプロトコルは、 シロイヌナズナ の男性減数分裂前期におけるセントロメアの動きを取得、分析、および定量化する方法を説明しています。...

シロイヌナズナにおける男性減数分裂前期中のセントロメア運動のライブイメージング特性評価

255 ビュー.  National Autonomous University of Mexico (UNAM). 我々の研究は、トウモロコシの雄性形成細胞を研究し、単一の細胞内で減数分裂タンパク質を視覚化する3Dアプローチの開発に焦点を当てています。トウモロコシ以外にも、このプロトコルはイネ、ライ麦、オオムギ、コムギの形成細胞の研究にも適用できます。始めるには、V13段階で茎の内側でまだ成長している花序を持つトウモロコシ植物を入手します。減数?...

トウモロコシ減数細胞における三次元免疫局在化

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