トウモロコシ減数細胞における三次元免疫局在化

本研究では、トウモロコシの雄性減数分裂細胞を研究し、単一細胞内で減数分裂タンパク質を可視化するための3Dアプローチの開発に焦点を当てています。このプロトコールは、トウモロコシ以外にも、イネ、ライムギ、オオムギ、コムギの減数分裂細胞の研究に適用可能です。まず、花序がまだ茎の中で成長しているV13段階のトウモロコシ植物を用意します。

減数分裂期の葯を固定する週に、手袋を着用して、肥大した茎の膨らみ部分を軽く押し、切り開くのに十分な柔らかさであるかを確認します。必要な緩衝液を調製した後、プラスチックボックスの中に加湿したペーパータオルを5〜10枚入れて、湿潤チャンバーを準備します。チャンバー内の余分な水を取り除いてください。

カミソリを用いて、花序レベルで茎を切り開き、雄穂の分枝および側枝を露出させます。側枝を切り出して回収した後、チャンバーを室温に保ったまま、湿潤チャンバー用のタオルで側枝を包みます。実体顕微鏡を用いて、小花から新鮮な葯を回収し、2 mLの1X buffer AまたはBAを入れた35 mmのペトリ皿に入れます。大きさおよび色に基づいて、有糸分裂のステージを判定します。

葯を新しい35 millimeterのペトリ皿に移した後、3 millilitersの固定液を葯に加えます。ホルムアルデヒドの蒸発を防ぐため、ペトリ皿をパラフィルムで密封します。35 millimeterのペトリ皿を、ロータリーシェーカー上に配置した大きめのペトリ皿に乗せ、室温、40 to 60 RPMで45分間振とうします。

葯を3 mLの1 XBAで洗浄します。葯を小型のペトリ皿に移した後、ペトリ皿を密閉し、室温で速度を40～60 RPMに設定した回転振盪機に45分間置きます。清潔なピンセットを使用して、葯を3 mLの1 XBAが入った小型の35 mmペトリ皿に移します。

ペトリ皿をパラフィルムで密に密封した後、小さなペトリ皿をより大きなペトリ皿の中に入れます。アルミ箔で覆い、使用時までサンプルを4 °Cで保存します。1日目に、アクリルアミドと2 XBAを等量ずつ混合し、2 mLのアクリルアミド溶液を調製します。

亜硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムを加える前に、アクリルアミド溶液を真空下で5〜10分間脱気します。準備したスライドの数に合わせて、アクリルアミドと2 XBAを1:1で混合した溶液を100 µLずつ1.5 mLチューブに分注します。2 cm × 2 cmのパラフィルムの断片をシャーレの上に置き、実体顕微鏡の下に配置します。

ハサミでピペットチップをカットした後、葯を含むBA溶液を50 µL、パラフィルム上にピペットで滴下します。別の箇所にBA溶液を25 µL滴下します。ピンセットで葯を固定し、メスを用いて先端を切り取ります。

減数分裂細胞を絞り出した後、ピペットを用いてそれらを25 µLのBA液滴に移し、静かに混ぜ合わせます。減数分裂細胞の混合液10 µLを別のカバーガラス上に分注します。アクリルアミドと2X BAを含む1.5 mLチューブに、亜硫酸ナトリウム5 µLと過硫酸アンモニウム5 µLを迅速に加えます。

この混合液を5 µLピペッティングしてカバーガラス上に滴下し、メイオサイトと混合させます。ポリリシンコートされたカバーガラスを45度の角度で上に載せます。室温で30〜50分間静置して完全に重合させた後、カミソリを用いて慎重にカバーガラスを分離させます。

次に、パッド面を上にしてペトリ皿に配置します。室温で、1 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と1% Tritonを添加した1X PBS 1 mLを用いて、カバーガラスを2時間洗浄します。検出時に異なるシグナルを確実に得られるよう、異なるホスト種由来の一次抗体を調製し、混合します。

希釈した一次抗体 50 µL を、パッドが載ったカバーガラスの中央に加えてください。その後、ペトリ皿を加湿チャンバーに入れ、一晩静置します。2日目に、1× PBS、0.1% Tween 20、および 1 mM EDTA を含む洗浄バッファー 500 mL を調製します。

ピペットを使用して、一晩反応させた溶液を除去します。カバースリップを1 mLの洗浄緩衝液で2回洗浄します。緩衝液を除去した後、再び1 mLの洗浄緩衝液を加え、室温で1時間インキュベートします。

この洗浄ステップをさらに7回繰り返します。最後の洗浄後、ディッシュに蓋をして加湿チャンバー内で一晩静置します。ブロッキングバッファーを用いて、二次抗体を50倍に希釈して準備します。

洗浄液を除去した後、希釈した二次抗体50 µLを各パッドの中央に加えます。次に、ペトリ皿を湿潤チャンバーに入れ、室温で2時間置きます。ウェルから溶液を除去した後、1 mLの洗浄バッファーを用いて、室温で1時間ずつ4回洗浄します。

ウェルを1 mLのPBSで10分間洗浄し、この工程をさらに2回繰り返します。最終濃度を1 µg/mLに調製したDAPIを500 µLウェルに添加し、室温で30分間インキュベートします。4 °Cで保存されていたプロロングドゴールドを取り出し、室温になるまで融解させます。

スライドを1 mLのPBSで30分間洗浄し、これを2回繰り返します。最後の洗浄液を除去した後、パッドの中央にProlonged抗退色剤を2滴滴下します。ウェルからカバーガラスを持ち上げ、ラベルを貼ったスライドの上に封入します。

真空吸引を用いてカバースリップの端から余分なグリセロールを除去し、ネイルポリッシュを2度塗りして封印します。適切な励起波長とフィルターを用いて顕微鏡下でスライドを観察し、画像をキャプチャします。DAPI染色により、明瞭な核およびクロマチンの染色とともに、プラスチドおよびミトコンドリアDNAのより淡い天然の細胞質染色が認められました。

前レプチネマ期において、first division oneまたはAFD1、asynaptic oneまたはASY1、およびZipper1またはZYP1が染色体上および細胞質に局在している。その後、信号は染色体上に集中したが、完全な接合が起こるまで相当量のZYP1が細胞質に留まっていた。減数分裂コヒーシンであるAFD1は、ジゴネマ期に入って初めて線状構造を形成した。

接合複合体の線状フィラメントの形成と同時に、ZYP1およびAFD1が線状構造に組み込まれた後、ASY1のシグナルは相対的に弱くなりました。本プロトコルにより、研究者はタンパク質の共局在とダイナミクス、本来の細胞内局在、3D染色体構造、減数分裂の進行およびステージングを解析することが可能です。

このプロトコルの主な課題は、一次抗体と二次抗体の適合する組み合わせを慎重に選択することです。本研究に基づき、雄と雌の減数分裂を比較することで、athelchasmiの根底にある分子メカニズムを調査する研究へと発展させることができます。