Name: ビーズを用いたアクチンコメットテール運動アッセイにおける、ミオシンI介在性の分岐アクチン構築の再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶビーズを用いたアクチンコメットテール運動アッセイにより、ミオシンIとArp2/3複合体が膜様界面で分岐アクチン構築を調節する分子メカニズムを再構成・可視化・定量的に解析する方法。このプラットフォームは細胞骨格動態の研究に応用可能です。

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タンパク質精製において優れた技術的支援をいただいたDaniel Safer博士とRick Wike氏に感謝いたします。Arp2/3複合体およびCapZタンパク質を寛大にご提供いただいたRoberto Dominguez博士、特にMalgorzata Boczkowska博士とGrzegorz Rebowski博士に感謝いたします。また、プロジェクト全体を通じて貴重なご助言をいただいたLuther Pollard博士、Faviolla A. Báez-Cruz博士、およびOstap研究室とDominguez研究室の全メンバーに感謝いたします。本研究は、国立衛生研究所（NIH）の助成金R37 GM057247（E.M.O.宛）の支援を受けました。E.M.O.とM.X.は、全米科学財団（NSF）（CMMI-1548571）から一部支援を受けました。原稿の改訂における言語編集の補助としてChatGPTが使用されました。著者はAIによる支援を受けたすべての内容を確認・編集し、最終的な原稿に全責任を負います。

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著者らは、競合する金銭的利益または利益相反がないことを宣言します。

アクチンコメットテールビーズ運動性アッセイは、Arp2/3複合体介在性の分枝アクチン重合および、それが突出力の生成に果たす役割を調査するための、確立されたin vitro再構成系である14,15,16,17。この系は、分枝アクチン重合の生化学的な調節14,15,26,27,31,49,50,51および力生成20,21,22,23,52を解析するために広く応用されており、同時にアクチンネットワークの創発的なアクティブマター特性に関する定量的な研究のための枠組みも提供している19,35,36,53。この再構成系にミオシン、特にmyosin-I18を組み込むことで、改変されたアッセイにより、ミオシン-アクチン結合が膜界面におけるアクチン重合と力生成をどのように調節するかを調査することが可能になる。この領域は、比較的未探索のままである。特に、本系におけるmyosin-Iを他のミオシンモーターに容易に置き換えることで、アクチンネットワークのリモデリングと力生成におけるそれぞれの役割を検討できる。例えば、myosin V（カーゴ輸送）54、myosin VI（エンドサイトーシス輸送および膜ダイナミクス）55,56、myosin VIIおよびXV（ステレオシリアおよび微絨毛の組織化）57,58,59、myosin X（フィロポディア形成）60,61、およびmyosin XIX（ミトコンドリアダイナミクス）62を組み込むことで、異なるクラスのミオシンがアクチン組織化とその関連生理学的プロセスにどのように寄与しているかを調査できる。
いくつかの重要なパラメータを慎重に制御することで、本アッセイの高い再現性を得ることができます。第一に、強固なコメットテイル（彗星状の尾）を形成させるには、高品質なモノマー状G-actinが不可欠です。確立されたプロトコル41を用い、ウサギ骨格筋アセトン粉末からG-actinを精製することを推奨します。2～3日間の透析後、モノマー状アクチンをG-buffer（2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; 0.5 mM DTT）を用いたSephacryl S-300によるゲルろ過でさらに精製してください。溶出ピーク直後に回収したフラクションを使用します。精製したG-actinは、通常4°Cの氷上で保存した場合、2～3週間は強い重合活性を維持し、4週目まで使用可能な場合もありますが、一般的にその後は性能が低下します。アクチンネットワークが疎で脆く、テイルの伸長が不均一であるなど、コメットテイルの堅牢性が低下している場合は、多くの場合、アクチンの品質低下を示しています。第二に、NPF活性がコメットテイル形成の決定的な要因となります。ヒト神経系Wiskott–Aldrich症候群タンパク質（N-WASP）由来の市販のGSTタグ付きWCAドメイン（GST-VCA）は、強固で持続的な核形成活性を提供し、GSTの二量体化によってこの活性がさらに増強されます63。ビーズコーティングの前に、ピレンアクチン重合アッセイを用いて、使用するNPF構築物の活性を検証することを推奨します。市販のGST-VCAの活性をリファレンス標準として利用できます。なお、本法で使用した市販のGST-VCAにはポリプロリン領域を欠いているため、プロフィリン-アクチン複合体とは相互作用しません26。第三に、コメットテイルの伸長を確実に可視化するには、スライドガラスとカバーガラスの丁寧な準備が必要です。スライドガラスとカバーガラスを水とエタノールで十分に洗浄し、使用直前にプラズマクリーニングを行うことを推奨します。入手可能な場合は、非特異的なタンパク質吸着を最小限に抑え、再現性を向上させるポリエチレングリコール・シラン化カバーガラス26の使用が好ましいです。また、運動性混合液に適当な濃度のBSAを含めることで、非特異的な表面相互作用をさらに減少させ、一貫したアッセイ性能を促進できます。第四に、チャンバーに適用するサンプル量は、信頼性の高い測定を行う上で極めて重要です15,16,17。サンプル量が多すぎるとビーズが漂流し、コメットテイル伸長の正確な追跡ができなくなります。逆にサンプル量が少なすぎると、スライドガラスとカバーガラスの間でビーズが圧縮され、摩擦が増加してビーズが固定されてしまいます。この機械的な制約は、コメットテイルの形態を歪ませ、測定される成長キネティクスを変化させる可能性があります。したがって、再現性のある結果を得るには、チャンバーの高さとサンプル量の両方を最適化することが不可欠です。各実験セットアップに合わせて、サンプル量を経験的に最適化することを推奨します。本法で説明している22 mm × 22 mmのカバーガラスを使用する場合、運動性混合液を2.1–2.3 µL適用すると、チャンバーの高さが約4.3 µmとなり、過度な漂流や圧縮なしに直径2.0 µmのビーズを安定して配置できます。&#160;異なるサイズのカバーガラスを使用する場合は、チャンバーを均一に満たし、ビーズを安定して配置させ、サンプルの漂流を最小限に抑えるよう、適宜サンプル量を調整してください。
コメットテイルが形成されない場合は、アクチン重合能およびNPF活性を確認してください。対称性の破れが起こらない場合は、CP濃度を調整してネットワーク密度を制御してください。ネットワーク密度が過剰に高いと破断に抵抗し、逆に低すぎると構造的完全性が失われます。ミオシン被覆ビーズがコントロールビーズと差を示さない場合は、ミオシンの表面密度およびモーター活性を確認してください。品質管理における判定基準は、絶対的な数値のカットオフではなく、機能的な基準に基づきます。以下の条件を満たす場合、新しい調製物は許容されるとみなされます。&#160;これは、以前に検証された調製法（〜に示される通り）で観察されたコメットテールの形成および伸長を再現しています。&#160;図3）。さらに、ミオシン、Arp2/3複合体、NPF、CapZ、またはアクチンの新しい調製物は、使用前に適切な品質管理アッセイを用いて評価し、定量的な実験における一貫性を確保するために、以前に検証済みの調製物と比較する必要があります（参照 プロトコルセクション 3.1).
結果を解釈する際には、本アッセイのいくつかの制限を考慮する必要があります。第一に、蛍光強度はアクチンネットワーク密度の相対的な、未校正の代替指標として使用されています。したがって、同一の取得設定で撮影され、同一の閾値処理ワークフローを用いて解析されたサンプル間でのみ比較を行う必要があります。第二に、ビーズの可動性、コメットテール（彗星状の尾）の成長、および成長効率は、力を生成するネットワーク挙動の間接的な読み取り値を提供しますが、力の直接的な測定ではありません。ネットワークによって生成される力を定量化するには、光学的トラッピングや力校正済み膜変形アッセイ64,65などの直接的な機械的測定が必要です。第三に、本アッセイでは、フィラメントの配向、分枝密度、または局所的なミオシン組織などのアクチンネットワークの超微細構造を直接分解することはできません&#160;。ナノスケールの構造&#160;特性評価には、電子顕微鏡法や超解像イメージングなどの相補的なアプローチが必要となる場合があります。最後に、剛性のミクロンサイズビーズの使用は、簡略化され実験的に扱いやすいインターフェースを提供しますが、細胞膜の変形能、曲率の不均一性、脂質の可動性、または分子的な複雑さを捉えることはできません。したがって、細胞のリーディングエッジにおいて細胞骨格成分がどのように協調しているかを調査するためには、より生理学的に適切なインターフェースの今後の開発が重要となります。
全体として、この再構成アプローチはタンパク質の組成と濃度を精密に制御することを可能にし、細胞システムでは困難な方法で個々の構成要素をメカニズム的に分析することができます。これにより、分子モーターがどのように分枝アクチンネットワークを再編し、膜様界面における力発生を制御するかを研究するための汎用性の高いプラットフォームが提供されます。適切なバリデーションを行うことで、このアッセイを拡張し、異なるマイオシン類、変異体または疾患関連モーター変異体、および力感受性アクチン結合タンパク質が、動的なアクチンネットワーク内での機械的フィードバックをどのように調節するかを検討することが可能です。より広義には、本システムは分子スケールのモーター活性をメゾスケールの細胞骨格組織化および機械的機能へと結びつける一助となり、細胞運動、エンドサイトーシス、および膜再編への示唆を与えます。

アクチン関連タンパク質2/3（Arp2/3）複合体によって媒介される分枝アクチン重合は、細胞運動、エンドサイトーシス、食作用、および細胞接着複合体の形成を含む多様な細胞プロセスを駆動する主要な推進力を生成します1,2,3,4,5,6。遊走細胞の最前縁において、核形成促進因子（NPF）が細胞膜上のArp2/3複合体を活性化し、膜を前方へ押し出す樹状アクチンネットワークの構築を開始させます。ミオシンIモーターは、膜界面においてこれらの分枝アクチンネットワークとしばしば共局在しており、&#160;アクチンの構造組織化&#160;の制御および力発生の調節に関与していることが示唆されています7,8,9,10,11,12,13。ミオシンIがアクチン依存的な機械的プロセスに寄与しているという証拠が集まっているにもかかわらず、ミオシンIがArp2/3媒介の分枝アクチン構築とどのように相互作用してネットワーク構造や機械的出力を調節するかという分子メカニズムについては、まだ十分に解明されていません。
この課題を解決するため、我々は確立されたアクチンコメットテールビーズ運動システム14,15,16,17にmyosin-Iを組み込み、マイクロサイズビーズの表面でmyosin-I、アクチン、およびArp2/3複合体の相互作用を再構成しました。本手法の全体的な目的は、膜のような界面において、myosin-actinの共役が、分岐アクチンの構築、ネットワーク構造、対称性の破れ、およびビーズの運動性にどのように影響するかを定量的に調査することです。このアッセイでは、myosin-IとNPFをマイクロスケールビーズに共コーティングし、細胞質膜におけるそれらの共局在を模倣します18。重合が開始されると、表面に結合したNPFがArp2/3依存的な分岐アクチン構築を刺激し、アクチンシェルの形成、対称性の破れ、そしてビーズの推進力を生み出す極性化したコメットテールの形成へと導きます&#160;14,19,20,21,22,23。myosinの表面密度を系統的に変化させ18、さらにキャッピングタンパク質（CP）濃度によってアクチンネットワーク密度を調節することで15,19,24、本手法によりアクチン構築のキネティクス、成長効率、ネットワーク構造、およびビーズの運動性の定量分析が可能となり、myosin-I依存的な機械的出力の変化に関する間接的な読み取り値を得ることができます。
このアッセイは、相補的なアプローチに対しても明確な利点を持っています。ピレン-アクチンアッセイなどのバルク重合アッセイと比較して、このビーズ運動システムでは、分岐アクチンの構築とアクチン重合駆動によるビーズの移動を直接的に可視化することが可能です。また、タンパク質機能の重複や複雑な細胞内環境によって個々の寄与が不透明になり、解釈が困難になる細胞研究とは対照的に、本アッセイではタンパク質の組成、濃度、および表面構成を精密に制御でき、それによって、定義された生化学的条件下でmyosin-IがArp2/3介在性アクチン構築とどのように相互作用するかを体系的に調査することが可能になります。
この手法は、膜様&#160;界面において細胞骨格成分がどのように協調してアクチンネットワークの構造と力学的出力を制御するかを研究するのに最適です。現在のプロトコルはmyosin-I介在性の分枝アクチン構築に最適化されていますが、そのモジュール設計により、将来的には他の膜結合性ミオシン類（例：myosin VI, VII, X, XV, XIX）や、アクチン結合タンパク質（例：formin、血管拡張刺激ホスホタンパク質 (VASP)、cortactin、coronin、tropomyosin）の検討に応用できる可能性があります。このような適応には、タンパク質の固定化、活性、および表面密度の検証が必要です。さらに、このアッセイはパルス追跡標識戦略にも対応しています。光変換または光活性化アクチン、あるいは標識したArp2/3サブユニットを組み込むことで、成長するネットワーク内でのフィラメントの代謝回転や分枝の解離速度の測定が可能になります25。総じて、本アッセイは、膜結合性モーター、アクチンフィラメント、およびアクチン結合タンパク質間の分子的な相互作用を検討し、膜様界面においてモーターとアクチン結合タンパク質がネットワークのリモデリングと力発生をどのように制御するかを調べるための汎用性の高いプラットフォームを提供します14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34。より広範には、対称性の破れ、自己組織化、メカノケミカルフィードバック、および活性アクチノミオシンネットワークにおけるその他の創発的挙動など、モーター駆動の非平衡ダイナミクスの根底にある物理的原理を調査するための、最小限で調整可能なアクティブマタープラットフォームとしても機能し18,19,20,21,22,23,35,36、アクティブマター物理学や材料工学への応用の可能性があります。

<table><tbody><tr><td>アデノシン 5&amp;prime;-三リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>シグマ</td><td>A26209</td><td>ATP含有バッファーの調製に使用。分注して以下で保存する。 &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Arp2/3複合体</td><td>院内調製</td><td>翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する原文をご提示ください。</td><td>分岐したアクチンネットワークを核形成させるために使用。精製は文献42に従って実施した。</td></tr><tr><td>ビオチン-CF640蛍光色素</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>コントロールビーズの蛍光標識に使用。遮光して～に保存。 &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ビオチン化Myo1d</td><td>院内調製</td><td>該当なし</td><td>ミオシン被覆ビーズの修飾に使用したモータータンパク質。文献18および38に記載の方法に従って調製した。&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td>ビーズブロッキングおよびビーズ保存バッファーに使用します。ろ過済みのストックソリューションを調製してください。</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td>Xバッファーおよびカルシウム阻害実験に使用されるバッファー成分。</td></tr><tr><td>カルモジュリン</td><td>院内で調製</td><td>該当なし</td><td>ミオシン含有反応液およびビーズ保存バッファーに添加した。精製は参考文献44に従って行った。</td></tr><tr><td>カルボキシル化ポリスチレンビーズ (2.0 &amp;micro;m 直径)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>NPF、NeutrAvidin、蛍光色素、およびミオシンのコーティング用固相支持体として使用。保存温度： 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>タイムラプス顕微鏡観察における蛍光画像の取得に使用される。</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー染色</td><td>シグマ</td><td>B7920</td><td>デンシトメトリー分析の前に、SDS-PAGEゲルを染色するために使用します。</td></tr><tr><td>カバーガラス、22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>地球儀</td><td>1404-15</td><td>顕微鏡スライドと併用して、スクイーズチャンバーを組み立てるために使用します。</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>緩衝液および運動性混合液に使用される還元剤。保存温度は &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ドライスクロール真空ポンプ</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>プラズマクリーニングシステムの操作に使用します。</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Mバッファー、運動性バッファー、およびアクチン前処理に使用されるカルシウムキレート剤。</td></tr><tr><td>外部光源</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>蛍光顕微鏡用メタルハライド光源。</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>オープンソース</td><td>翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストをご提示ください。</td><td>コメットテイルの長さ、蛍光強度、およびネットワーク密度の解析に使用（バージョン 2.16.0/1.54p）。</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMIRB</td><td>アクチンコメットテイルのイメージングに使用した倒立蛍光顕微鏡。</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>SDS-PAGEゲルの脱染色溶液の成分であり、腐食性があるため、適切な注意を払って取り扱うこと。</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>細胞骨格</td><td>VCG03-A</td><td>Arp2/3介在性アクチン重合に使用される核形成促進因子；分注して以下に保存 &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Xバッファー、Mバッファー、および運動性バッファーに使用される緩衝剤。</td></tr><tr><td>ヒトCapZ</td><td>院内調製</td><td>該当事項なし</td><td>アクチンネットワークの密度調節に使用したキャッピングタンパク質。精製は参考文献43に従って行った。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>反応バッファーおよびアクチン前処理に使用されるバッファー成分。</td></tr><tr><td>MetaMorphイメージングソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>該当なし</td><td>顕微鏡の制御および画像取得に使用（バージョン7.10.4.459）。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td>MX0485-3</td><td>SDS-PAGEゲルの脱色溶液の成分。可燃性であるため、施設内の安全手順に従って取り扱うこと。</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマ</td><td>M0387</td><td>溶液の粘性を高めるため（1500 cP）、モティリティバッファーに添加した。</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドグラス</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>顕微鏡観察用のスクイーズチャンバーを組み立てる際に使用します。</td></tr><tr><td>NeutrAvidinタンパク質</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>ビオチン化タンパク質をビーズ表面に固定化するために使用します。分注して以下に保存してください。 &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus プレステインタンパク質ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>SDS-PAGE分析に使用される分子量マーカー。保存条件： &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>チャンバーの組み立て前に、顕微鏡スライドガラスおよびカバーガラスをプラズマ洗浄するために使用します。</td></tr><tr><td>ポリエーテルスルホン製シリンジフィルター 0.22 &amp;micro;m</td><td>シグマ</td><td>SLGPR33RS</td><td>分注前に牛血清アルブミンストック溶液をろ過するために使用する。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>アッセイバッファーのイオン強度を維持するために使用される塩。</td></tr><tr><td>ウサギ骨格筋アクチン</td><td>院内調製（または 自社調製）</td><td>入力がありません。翻訳するテキストをご提供ください。</td><td>文献41に従って精製し、アクチンコメットテイル構築アッセイ用G-アクチンとして使用した。</td></tr><tr><td>冷却マイクロ遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>ビーズの調製および洗浄ステップにおけるビーズのペレット化に使用する。</td></tr><tr><td>回転チューブミキサー（ベンチトップローテーター）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>ビーズの懸濁状態を維持するため、ビーズコーティングのインキュベーション中に使用します。</td></tr><tr><td>Tris/グリシン/SDS電泳バッファー（10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1まで希釈する&amp;times; SDS-PAGE電気泳動の前。</td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>蛍光イメージング前にスクイーズチャンバーを密閉するために使用します。</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20%勾配SDS-ポリアクリルアミドゲル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>ビーズ結合タンパク質のSDS-PAGE解析に使用。保存条件： 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

ビーズを用いたアクチンコメットテール運動アッセイにおける、ミオシンi介在性の分岐アクチン構築の再構成

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

アクチン関連タンパク質2/3（Arp2/3）複合体によって媒介される分枝アクチン重合は、細胞移動、エンドサイトーシス、および食作用を含むさまざまな細胞プロセスに主要な推進力を提供します。細胞のリーディングエッジにおいて分枝アクチンネットワークと頻繁に共局在するミオシンIモーターも、これらのプロセスに関与していることが示されており、アクチンネットワークの組織化および力学的出力を制御していると考えられています。しかし、ミオシンIがArp2/3複合体と相互作用して分枝アクチン構築および力生成を調節する分子メカニズムは、依然としてほとんど解明されていません。本稿では、ミクロンサイズのビーズ表面上で、細胞のリーディングエッジにおけるミオシンI、アクチン、およびArp2/3複合体の相互作用を再構成した、高度に調整可能なin vitroアクチンコメットテールビーズ運動性アッセイについて説明します。この手法は、核形成促進因子（NPF）と共にミオシンIをビーズ表面に共固定することで、膜のようなアクチン構築界面を作り出し、確立されたアクチンコメットテールアッセイを適応させたものです。本アッセイにより、アクチンネットワークの構築、ネットワーク密度、ビーズの運動性、および成長効率の視覚化と定量分析が可能になります。また、分枝アクチンネットワークにおけるミオシンI介在性の力強化を間接的かつ定性的に読み取ることができます。本プロトコルには、ビーズの機能化、反応系の構築、蛍光イメージング、定量的な画像解析、およびトラブルシューティング戦略が含まれており、膜様界面におけるミオシンI調節アクチン構築を研究するための再現可能なプラットフォームを提供します。

本プロトコルでは、ミオシンモーター活性が膜様界面における分枝アクチン assembly およびネットワーク構造にどのように影響するかを定量的に調査するための、調整可能なアクチンコメットテールビーズ運動性アッセイについて解説します。

ビーズを用いたアクチンコメットテール運動アッセイにおける、ミオシンI介在性の分岐アクチン構築の再構成

アクチン関連タンパク質2/3 (Arp2/3) 複合体によって媒介される分枝状アクチン重合は、さまざまな細胞内...における主要な推進力を提供します。

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ビーズを用いたアクチンコメットテール運動アッセイにおける、ミオシンI介在性の分岐アクチン構築の再構成

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