シロイナ根における発生および環境ストレスにおける核形状とクロマチン動態の定量的ライブセルイメージング

私たちの研究は、浸透圧からの根の長期回復を可能にする遺伝子とメカニズムを調査し、干ばつに備えて作物を強化しています。シロイヌズナの根のために開発されたこのプロトコルは、蛍光タンパク質マーカー系統を持つシステムにも適応可能です。画像撮影のために準備されたシロイヌズプシス・タリアナの苗を含む成長プレートを入手してください。

純粋な水60マイクロリットルをガラススライドにピペットで注ぎます。6日目のA.thalianaの苗根を3本水に置きます。葉を覆わずに根の上に22x22mmの1.5mmのカバースリープを敷きます。

共焦点顕微鏡の設定では、レーザー露光時間を1,000ミリ秒に設定します。レーザーコンバイナー設定で、488ナノメートルレーザーを50%に設定し、緑色蛍光タンパク質(GFP)イメージングを行います。赤色蛍光タンパク質(RFP)イメージング用に561ナノメートルレーザーを50%に設定します。

20倍対物レンズで光学ズームなしで試料を画像します。Zスライスのステップサイズを0.3マイクロメートルに設定します。撮影間隔を1分に、総撮影時間を10分に設定します。

根を特定し、最大20個のZスライスを選択します。16ビット画像をキャプチャする。タイムラプスの取得を開始し、タイムラプスをロスレス圧縮でTIFFファイルとして保存します。

取得したデータをコンピュータに移して分析してください。ImageJまたはFijiのソフトウェアを開いてください。VSIファイルをクリックして、メインのImageJまたはFijiアプリケーションウィンドウにドラッグしてください。

Bio Formats Import Optionsのプロンプトで、右下のOKをクリックします。次に、バイオフォーマットのシリーズオプションプロンプトでシリーズ1を選択してください。左下のOKをクリックします。

画像が読み込まれたら、画像を選択して信号を分割します。カラーを選択し、チャンネル分割を選択します。GFP標識核とRFP標識クロマチンごとに生成される別々のウィンドウをご覧ください。

2つの画像ウィンドウのうち、どの画像ウィンドウがクロマチンに対応しているかを特定します。クロマチン画像ウィンドウをクリックした後、Zプロジェクト操作を適用します。画像を選択し、スタックを選び、メインのImageJウィンドウからZプロジェクトをクリックします。投影タイプを最大強度に変更してください。

すべての時間枠が有効であることを確認し、OKをクリックして投影を生成してください。コントラストメニューを開くには、Control Shift Cを押すか、Imageを選択して調整を選択し、メインのImageJウィンドウからBrightnessまたはContrastをクリックしてください。最小バーを左にスライドさせ、クロマチンがはっきり見えるまで続けます。

プラグインに移動します。プラグインメニューの下矢印をクリックすると、トラッキングオプションにスクロールできます。「追跡」を選択して「TrackMate」をクリックします。

キャリブレーション設定が正確か確認して「次へ」をクリックします。閾値検出器を選択し、「次へ」をクリックします。画像ウィンドウのタイムラプスの最後のフレームに移ります。

強度閾値の隣にある「自動」をクリックし、「プレビュー」をクリックしてください。強度の閾値を調整してプレビューをクリックします。調整とプレビューのプロセスを繰り返し、ノイズを最小限に抑えて全クロマチンを含めるまで繰り返し、「次へ」をクリックします。

初期の閾値検出が完了するのを待ってから、「次へ」をクリックします。手動で閾値を調整してクロマチンだけが見える状態になり、「次へ」をクリックします。蛍光画像表示を調整し、「次へ」をクリックします。

「Simple LAP Tracker」を選択し、「次へ」をクリックします。リンク最大距離を5ミクロン、ギャップクロージング最大距離を15ミクロン、ギャップクロージング最大フレームギャップを1に設定し、次へクリックします。追跡完了を許可してください。

元の画像ウィンドウに表示されるトラックを確認し、「次へ」をクリックします。左下の緑色のプラスボタンを押すとフィルターを作成できます。トラックモードでスポット数を選択します。

しきい値スライダーを調整してください。フィルターモードが「上」に設定されているか確認し、次にクリックします。表示オプションページの下部にあるトラックボタンをクリックしてください。

「CSVにエクスポート」を選択します。内蔵のプロットページは無視して「次へ」をクリックします。TrackMateの分析結果を確認してください。

キャプチャオーバーレイをクリックしてから実行を選択します。「ファイル」を選択して「名前を付けて保存」をクリックし、その後「GIF」を選択して動画を保存します。塩処理された根細胞はストレスを受けており、中心子焦点は対照条件下よりも大きく見えました。

クロマチン速度は、100ミリモラ塩化ナトリウム処理条件下よりも対照条件下で有意に高かった。このプロトコルにより、シロイナズナの根における蛍光標識タンパク質の移動を時間経過で追跡・定量化することが可能になります。このプロトコルで最も重要な課題は高品質な画像を得ることです。なぜなら、写真漂白やサンプルドリフトによって追跡が困難になるからです。

今後の研究では、本研究で観察されたクロマチン移動減少のメカニズムを調査すべきです。