CaMPARIを用いた ショウジョウバエ 幼虫の中枢神経系における個々のシナプス前後パートナーの機能的特徴付け

私たちの研究は、生体および解剖されたショウジョウバエ幼虫における定義された神経ノードパートナー間の機能的シナプス接続性の評価に焦点を当てています。従来の方法は解剖や物理的刺激を必要とします。このプロトコルは、未去勢の幼虫に光学遺伝学を用い、人工物を減少させます。

まず、トウモロコシ粉寒天培地を電子レンジで沸騰せずに8〜10秒ほど溶かし、固まらないように室温で冷やします。完全に冷却する前に、csChrimson活性化が必要なハエの培地を補うために、0.5ミリモラー濃度のオールトランスレチナール(ATR)を添加します。バイアルは光の当たるのを防ぐためにアルミホイルで完全に覆ってください。

CaMPARIおよびcsChrimson遺伝子を持つ処女女性と、GAL4およびLexAドライバー遺伝子を持つ男性を、準備された培地を含むプラスチックバイアル内で交配します。ATRをコントロールに使わない並行バイアルを準備してください。幼虫が第3齢期に達するまで、25度の温度で抱卵します。

絵筆を使って三齢幼虫を集めます。幼虫を0.1モルPBSを含む3ウェルマイクロスポットプレートですすぎて、付着した栄養を除去します。きれいな18×18ミリのカバースリップの四隅に少量のモデリングクレイを置きます。

幼虫をカバースリップのPBSの一滴に浸し、腹面を下に向けさせます。幼虫が入っているカバースリップの上にきれいな顕微鏡スライドを置きます。カバースリップを固定するには、角にモデリングクレイを塗り、幼虫を潰したりガラスを割ったりしない程度の圧力で固定します。

幼虫を含むスライドを40x/1.2対物レンズを備えた共焦点顕微鏡のステージに置きます。顕微鏡ソフトウェアのインターフェースで「ライブ」をクリックします。次にZスタックパネルの下で「Set First」→「Set Last」→「Stop」をクリックすると、CaMPARIを表す基線のシナプス後ニューロンZスタックを取得します。

チャンネルメニューで、488ナノメートルの緑色チャンネルを0.8%のレーザー出力で設定します。次に、561ナノメートルの赤色チャネルをレーザー出力0.8%に設定します。Zスタックメニューで、間隔値を1マイクロメートルに設定します。

取得メニューで「プリセット」を選択して256×256ピクセルの解像度を設定します。ライン平均値2、双方向走査、スキャン速度9、ピクセル時間の自動更新が可能です。すべての撮影は暗い環境で行い、実験全体を通じて同じ取得パラメータを維持します。

405ナノメートルの光変換光をレーザー出力0.5%に設定します。そして561ナノメートルの光遺伝子刺激による光を0.8%のレーザー出力まで。「ライブ」をクリックし、ヒストグラムパネルの「ベストフィット」を選択します。

両方のレーザーで幼虫を30秒間同時に刺激し、その後停止させます。基準線と同じパラメータを用いた刺激後ZStack取得では、ATR栄養幼生のレーザー刺激ニューロンで赤色CaMPARI蛍光を最小限に抑えて観察します。Fiji ImageJソフトウェアで「ファイル」をクリックし、「開く」を選択します。

BioFormatsのインポートオプションウィンドウでデフォルト設定で、OKをクリックして取得したZStack画像を開きます。画像メニューで「カラー」を選択し、次に「スプリットチャンネル」を選択して、取得した画像の赤と緑のチャンネルを表示できます。背景の引き算は「プロセス」をクリックし、「背景差し引き」を選択してください。

ポップアップウィンドウで、回転するボールの半径を50ピクセルに設定し、OKをクリックしてプロセススタックウィンドウで「はい」を選択してください。次に、分析メニューでツールを選択し、ROIマネージャーを選択するとROIウィンドウが開きます。フリーハンド選択ツールを使って、個々のセルの周囲に興味のある領域を輪郭線を描きましょう。

ROIウィンドウで「追加」を選択して選択したアウトラインを保存します。次に「測定」をクリックすると面積、平均、標準偏差、積分密度の結果が生成されます。同じ幼虫の複数の細胞に対して、緑と赤のチャネルをそれぞれ別々に繰り返します。

結果をスプレッドシートにエクスポートした後、各細胞の統合密度の赤対緑、またはR×G比を測定し、これらの値を平均して刺激前後の画像で幼虫あたりの平均R×G比を算出します。最後に、刺激前のR×G比から刺激前のR×G比を差し引いて、シナプス後のカルシウム活性を定量化して、蛍光またはデルタR/Gの変化を計算します。第3齢幼虫におけるクラスIV樹状化(cIVdaニューロン)と盆地4中間ニューロンとの機能的結合性研究では、盆地4中間ニューロンが光変換および光生成刺激前の細胞質CaMPARI発現により緑色蛍光を示したことが示されました。

基底条件下では赤色蛍光は検出されず、刺激前の光変換がなかったことが確認されました。同時光変換、光照射、光遺伝的刺激により、CaMPARIは緑色蛍光から赤色蛍光へと変換されました。制御における赤色蛍光の欠如は、光変換がcsChrimson媒介神経活動によって特異的に駆動されたことを示しています。

緑色蛍光によるデルタレッドは、実験動物でATRなしの対照群よりも有意に高かった。このプロトコルは、生体発生動物におけるシナプス前刺激の追跡と、その後の即時のシナプス後反応の追跡を可能にすることで、シナプスパートナーシップの確認に利用できます。最も難しいステップは、適切な動物の固定には、動物を傷つけずに動きを防ぐための十分な圧力が必要になることです。

将来の研究により、発生中の特定の神経集団間のシナプス接続の追跡、形成、強化、さらには排除も可能になる可能性があります。