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<ol><li>Winden, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberous+sclerosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Tuberous sclerosis complex.</a> Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).</li>
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<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-related+neuropathology+in+mutant+tsc2+zebrafish%3A+phenotypic%2C+transcriptomic+and+pharmacological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).</li>
<li>Ilyin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracerebroventricular+lipopolysaccharide+administration+on+behavioral%2C+neurochemical%2C+and+neurogenomic+responses+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish.</a> Behav Brain Res. 493, 115676(2025).</li>
<li>Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+examination+of+the+LPS-TLR4+immune+response+through+the+analysis+of+molecular+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions.</a> Cell Commun Signal. 23, 142(2025).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>ボロシリケートガラス毛細管（外径1.0mm/内径0.75mm）</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 （塩化カルシウム）</td><td>Chempur</td><td>118748703</td><td></td></tr><tr><td>キャリブレーションスライド（1/100mm）</td><td>Bresser</td><td>5916710</td><td></td></tr><tr><td>毛細管ホルダー（グリップヘッドセット4サイズ0）</td><td>Fertilart Sp. z o.o</td><td>5196082001</td><td></td></tr><tr><td>フレイミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Chempur</td><td>115752837</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL6</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>200-06-20UG</td><td>ストック濃度：10 &micro;g/mL、使用濃度：2 pg/nL（0.9％NaClで希釈）</td></tr><tr><td>インジェクターポンプFemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>KCl（塩化カリウム）</td><td>Chempur</td><td>117397402</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O（塩化マグネシウム六水和物）</td><td>Chempur</td><td>116120500</td><td></td></tr><tr><td>Femtojetマイクロインジェクター用Femtotipsマイクロローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td>EPE 5242956003</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスコープLeica M165 FC 1983倍率</td><td>Leica Microsysytems</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/ light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（塩化ナトリウム）</td><td>Chempur</td><td>117941206</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td>ストック濃度：20 mg/mL（超純水で調製）、使用濃度：0.5 mg/mL（E3で希釈）</td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>超純低融点アガロース</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>ZebraBox拡張 - フォトモーター応答EZBPMR</td><td>Animalab</td><td>https://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox</td><td>ViewPoint</td><td>https://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebrabox</td><td>自動分析チャンバー</td></tr></tbody></table>

tscゼブラフィッシュ幼虫の血流へのインターロイキン-6微注射による神経精神疾患様行動の研究

Microinjection of Interleukin-6 into the Bloodstream of TSC Zebrafish Larvae to Study Neuropsychiatric Disorder-Like Behaviors

TSCゼブラフィッシュ幼虫の血流へのインターロイキン-6微注射による神経精神疾患様行動の研究

Patients with tuberous sclerosis complex (TSC1/TSC2 mutations) exhibit variable expressivity of autism spectrum disorder (ASD), and maternal immune ...

私の研究では、IL-6が誘発する炎症が自閉症の遺伝的リスク変異とどのように相互作用し、脳の発達と機能に影響を与えるかを調査しています。広範なLPS誘発性炎症とは異なり、本プロトコールでは選択的にIL-6を上昇させるため、サイトカイン特異的な神経発達への影響を精密に調査することが可能です。まず、マイクロインジェクション用針、必要な試薬、および受精後2日目のゼブラフィッシュ胚を準備してください。E3培地を用いて1% weight per volumeのアガロース溶液を調製し、アガロースが完全に溶解して溶液が透明になるまで加熱します。アガロース溶液を短時間冷却します。表面に均一な層ができるよう、100 millimeterのペトリ皿に約30 millilitersを注ぎます。アガロースがまだ液状でありながら凝固し始めたところで、シリコン型を表面にそっと置き、均一な溝を作成します。受精後2日目の卵膜のある胚を約100個、50 mmの小型アガロースコートペトリ皿に移します。新鮮に調製したプロナーゼ溶液 4 mLを皿に加え、胚が完全に浸っていることを確認します。室温で3～5分間インキュベートします。実体顕微鏡下で、卵膜から胚が放出される様子を確認します。卵膜の酵素的除去を促進するため、ディッシュを時々ゆっくりと回転させるか、または円を描くように揺らしてください。大部分の胚が卵膜から脱出するまで継続します。新鮮なE3胚培地を5〜6回交換し、胚を十分に洗浄します。幼魚へのダメージを防ぎ、最適な培養条件を維持するため、すべての卵膜およびプロナーゼの残留物が除去されていることを確認してください。ガラス製パステールピペットを使用して、脱卵膜処理した幼虫 約50匹を、40 mLのE3培地が入った100 mmペトリ皿に移します。マイクロインジェクションまで、幼虫をE3培地で維持します。実体顕微鏡下で、微細ピンセットを用いて、あらかじめ準備したガラスキャピラリーの先端を慎重に折断し、開口径 約3 µmのマイクロピペットを作成します。対照群への注入用に0.9% (w/v) 塩化ナトリウム溶液を調製します。また、IL-6注入用として、0.9% 塩化ナトリウムを用いた 2 pg/nL のインターロイキン6（IL-6）溶液を調製します。注入時の視認性を高めるため、注入溶液 10 µL あたり 0.05% トリパンブルーを 1 µL 加えます。ピペットを使用して、溶液をマイクロローダーチップに充填します。次に、マイクロローダーチップを用いて、準備したマイクロピペット注入針に注入溶液を約3 µL逆充填し、気泡が入らないようにします。充填した注入針を、マイクロインジェクションシステムに接続するキャピラリーホルダーに固定します。次に、キャリブレーション用スライドにミネラルオイルを少量滴下します。ミネラルオイル中に液滴を排出させ、注入量をキャリブレーションします。0.01 millimeterスケール付きのキャリブレーション用スライドを用いて、液滴の直径を測定します。液滴量が約1ナノリットルになるよう注入圧を調整します。ストレスを最小限に抑え、一定の鎮静状態を確保するため、E3培地にトリカインを加え、最終濃度を1Xにして幼魚を少数のグループごとに麻酔します。受精後2日目の幼魚を個別に、凝固させたアガロース注入プレート上に移動させます。ディッシュを実体顕微鏡の下に置きます。ガラスピペットを使用して、キュビエ管がはっきりと見え、アクセスしやすいように、各幼虫の向きを慎重に調整します。実体顕微鏡下で心臓に向かって移動する血球を追跡し、キュビエ管の入口にマイクロピペットの先端を配置します。調製した溶液の最初の1滴をキュビエの管内に注入します。約20秒後、2滴目をキュビエの管内に注入します。注入後、幼虫を40 mLのE3培地が入った新しい100 mmペトリ皿にゆっくりと移します。幼魚を28.5 °Cのインキュベーターに戻し、回復させる。翌日、前述の手順に従ってマイクロインジェクション操作を繰り返す。受精後5日目に、行動解析、脳イメージング、または免疫蛍光分析などの後続のアプリケーションに幼魚を使用する。IL-6のマイクロインジェクションは、塩化ナトリウム注入と比較して、幼生の生存率に影響を与えませんでした。受精後5日目の生存率は、IL-6注入群とNACL注入群の間で差がなく、投与計画が良好に耐容され、非特異的な毒性が導入されないことが示されました。マイクロインジェクションは、注入していない兄弟個体と比較して、生存率をわずかに低下させました。ホモ接合体Tuberous Sclerosis Complex 2（TSC2変異体）は、野生型の兄弟個体よりもベースラインのプロスタグランジンE2（PGE2）レベルが有意に高いことが示されました。ヘテロ接合体TSC2変異体では、野生型の兄弟個体と比較してベースラインのPGE2の緩やかな上昇が見られましたが、有意ではありませんでした。IL-6の微量注入後、ヘテロ接合体TSC2変異体においてPGE2レベルが急激に上昇しました。オープンフィールド試験の結果、非注入対照群においてTSC2変異体は野生型の兄弟個体と比較して不安様行動の増加を示し、IL-6の微量注入はこの行動に影響を与えなかった。非注入対照群のTSC2ヘテロ接合体およびホモ接合体変異体は、野生型の兄弟個体およびIL-6を注入したTSC2幼魚よりも、アリーナの外縁領域で過ごす時間が有意に長く、中央部の探索行動が減少していた。IL-6の注入により、特にTSC2ヘテロ接合体変異体において、反復的で定型的な遊泳パターンが増加した。IL-6を注入したTSC2ヘテロ接合型変異体において、反復的なルーピングを示す個体の割合は、塩化ナトリウムを注入した対照群と比較して有意に増加しました。本プロトコルにより、ゼブラフィッシュにおける神経発達および行動に対する遺伝的環境の影響を評価するための、制御されたIL-6炎症研究が可能になります。本プロトコルを実施する際の重要な検討事項としては、針のサイズの統一、2 nLという精密な注入量、および幼魚がE3溶液の外に置かれる時間の最小化が挙げられます。今後の研究では、IL-6による炎症と遺伝的リスクが共同して脳の発達や行動にどのような影響を与えるかを調査することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュの急速な発展、小型サイズと透明性感染症の自然免疫制御の研究のための途方もない利点があります...

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

このビデオは、ゼブラフィッシュの幼生の脳にリポ多糖類(LPS)を微量注入して神経炎症を誘発する方法を示しています。幼虫をアガロースで裏打ちされた皿の上に置き、針を脳室に挿入し、LPSを注入します。注入されたLPSは、神経炎症を引き起こす免疫反応を引き起こします。...

リポ多糖類注射によるゼブラフィッシュ幼生の神経炎症誘発

本稿では、アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドを​​用いて成体ゼブラフィッシュの終脳の心室細胞における遺伝子発現の操作のための方法を示しています。私たちは、大人の脊椎動物の脳の機能的な研究のために使用することができ、効率的かつ迅速なプロトコルとして、この方法を提示する。...

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ...

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫モデルの脳室領域へのリポ多糖のマイクロインジェクションを実証し、結果として生じる神経炎症反応と神経毒性を研究します。...

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

私たちは、高速走査型共焦点顕微鏡法を利用して、発生中のゼブラフィッシュの視蓋でミクログリア細胞のライブイメージングを行い、これらの細胞のin...

ゼブラフィッシュ胚におけるミクログリア動態のライブイメージングとキャラクタリゼーション

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin...

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences.  炎症シグナルが遺伝的に感受性の高い生物の神経発達にどのように影響するかをモデル化するために、ゼブラフィッシュ幼虫のキューヴィエ管(共通主静脈)にIL-6を微量注射するプロトコルを提示し、炎症の制御された誘導と結節性硬化症複合体(TSC)における発生影響の評価を可能にします。

TSCゼブラフィッシュ幼虫の血流へのインターロイキン-6微注射による神経精神疾患様行動の研究

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