マッピングミクグリアパラメータソフトウェア(MMPS):定量的なミクログリア形態分析のためのオープンソースで使いやすいツール

ミクログリアパラメータのマッピングソフトウェア(MMPS)は、虚血性脳卒中後にフェロプトーシスがミクログリアサブ集団をどのように変化させるかを研究することを可能にします。MMPSはマイクログリア分析分野の主要なボトルネックを解決し、煩雑なソフトウェア要件や必要なコーディング知識を回避します。まずは、パソコンのGitHubリポジトリを開き、Mapping Microglial Parameters Software(MMPSスタンドアロンパッケージ)をダウンロードしてください。

ダウンロードフォルダで、ダブルクリックして圧縮フォルダを自動的に抽出するアーカイブユーティリティを起動します。抽出したMMPSアプリケーションアイコンをダブルクリックして確認し、MMPSパッケージを開きます。画像フォルダを選択するオプションをクリックし、コンピュータのディレクトリをナビゲートしてプロジェクトファイルを見つけてください。

フォルダへのアクセス権限を付与し、画像ストレージディレクトリを選択します。次に、出力フォルダを選択し、出力ディレクトリを選択します。処理する画像を選択し、画像ラベル付けを選択します。

画像に動物識別子と処理グループを割り当て、入力を保存します。画像のピクセルサイズを計算するには、スケールバーからキャリブレートを選択してください。スケールバーの開始点と終了点を選択し、既知のスケールバー距離をマイクロメートルで入力して「適用」をクリックします。

マイクログリア信号を含む蛍光チャネルを選択します。各画像名の横にあるチェックボックスにチェックを入れて処理対象画像を選択し、背景蛍光が画像ごとに異なる場合は個別に処理してください。元のタブ、プレビュータブ、処理済みタブ、マスクタブを確認し、画像処理の段階を比較してください。

追加の処理設定を調整するには、プレビュー現在の画像を選択してください。背景の引き算として、ローリングボールの値を5ピクセルから150ピクセルの間に設定します。照明アーティファクトを減らすには、ノイズ除去値を3にし、シャープニング値を1から2の間に設定してエッジの定義を改善します。

画像処理設定の最適化後、「選択画像の処理」をクリックします。次に「ソーマを選び、すべての画像」を選択します。RGBコンポジットビューを見るには「色Cを表示」をクリックしてください。

チャンネルを選択し、画像が色に歪んでいる場合は未使用チャンネルを選択してください。RGBビューでチャンネルの明るさを調整するには、ディスプレイ調整をクリックしてください。DAPIおよびイオン化カルシウム結合アダプター分子1、すなわちIBA1共局在を示すミクログリアソーマを選択します。

誤って選択したSomaはバックスペースキーやDeleteキーで削除してください。次の画像に進むには、Enterキーまたはリターンボタンを押してください。ソーマ選定が完了した後、ソーマの輪郭を選択します。

選択された各ミクログリア細胞のソーマ周囲を、細胞突起を除く少なくとも8つの輪郭点で描き出します。誤って配置されたアウトラインポイントは、最後のポイントを元に戻す、削除、バックスペースで削除してください。エンター、リターン、ダブルクリック、右クリックで各ソーマのアウトラインを最終決定できます。

ソーマのアウトライン作成が完了した後、すべてのマスクを生成をクリックします。マスク生成設定では、最小強度を調整して背景ピクセルを減らし、背景抑制と枝分岐保持のバランスを取ることができます。すべてのマスクの品質保証を選択し、最大から最小のエリアまですべてのマスクをレビューします。

各マスクを処理タブとマスクタブを使って対応するミクログリアと比較してください。マスクを受け入れるには、Aキーのショートカットを使います。マスクを拒否するには、Rキーのショートカットを使ってください。

承認または拒否を取り消すにはBキーを押してください。キーボードの矢印キーを使ってマスクのサイズをナビゲートしてください。隣接する細胞や過剰な背景、画像の境界線、スケールバーを含まず、マイクログリア分岐を正確に捉える最大で許容できるマスクを選択してください。ほとんどが不正確な場合は、「すべてのマスクをクリア」オプションを使って、異なる閾値でマスクを再生成してください。

次に、「簡単な特性を計算」を選択して、受け入れられたマスクのさまざまなパラメータを計算し、「OK」をクリックします。さらなる分析については、fractalanalysisimagejをダウンロードしてください。パイ、ショール。

py、そしてskeletonanalysisimagej。pyプラグイン。フラクタルやハル解析の場合は、fractalanalysisimagejを開いて実行してください。

pyをFijiプラグインとして使う。次に出力ディレクトリの場所を入力します。ピクセルサイズを入力し、最大マスクのみのオプションを選択してセルごとの最大許容マスクを解析します。

ショル解析にはオープンショルを選びます。pyをFijiプラグインとして使う。出力ディレクトリの場所、希望のピクセルサイズ、ステップサイズを入力します。

開始半径としてソーマ半径を使うか、MMPS由来のソーマ半径が使われない場合は固定のソーマ半径値を入力してください。開いたskeletonanalysisimagej。pyをフィジーのスケルトン解析プラグインとして使います。

マスクのディレクトリ、出力ディレクトリ、ピクセルサイズのパスを入力すると、プロンプトが出たら入力してください。終了後、プラグインが生成したすべての結果をカンマ区切られた値ファイルとして特定の出力ディレクトリにエクスポートします。リポ多糖またはLPS誘発の齧歯類神経炎症モデルを用いたMMPSの検証研究では、LPS投与が車両処理対照群と比較して平均重心距離と細胞周囲を有意に減少させることが示されました。

治療群間でマスク面積、丸み、離心率に有意差は認められませんでした。LPS処理動物では、活性化に関連するグリア細胞の形態学的再構築と一致する車両対照群と比較し、ソーマ面積が有意に増加しました。さらに下流では、高度な形態学的解析により、車両処理ラットではミクログリアの丸みと周囲の相関は弱いにとどまり、LPS処理ラットでは強い相関が見られ、微粒細胞活性化の増加と円度および周囲の減少との関連が示唆されました。

さらに、マスク領域は、車両群およびLPS処理群の両方で平均重心距離と強い正の相関を示し、ミクログリア活性化に関連する分岐の変化と一致しました。このプロトコルにより、研究者は複雑な微グリウム分岐、形態的均質性、構造的複雑性を研究できます。高解像度の免疫蛍光画像の取得は、MMPSを正確に利用するために非常に重要です。

将来の研究では、MMPSを活用して、筋中などの神経系疾患後にフェロプトーティック阻害剤が微膠細胞の形態をどのように変化させるかを研究できるでしょう。