Name: 真菌の種間相互作用における形態計測学的研究のための非接触共培養アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ真菌の種間相互作用における非接触共培養アッセイ。膜インサートウェルプレート法と細胞外上清液法を用いて、形態計測学的変化を定量的に解析し、微生物コミュニティの応答メカニズムを明らかにする。

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本研究は、RNPに授与されたDBT-Wellcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/19/1/504294) の支援を受けて実施されました。KBSSは、Ahmedabad University Special Research Grant (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) および SERB-Core Research Grant (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27) の支援を受けました。図1で使用されているアイコンは、CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) ライセンスの下で提供されているServier Medical Art (https://smart.servier.com/)、およびBioArt Source, NIAID, NIHから適応して作成されました。

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著者は、競合または相反する利益がないことを宣言します。

メンブレンインサートウェルプレートとCFSを用いたアッセイによる以前の報告では、C. albicansがC. glabrata細胞またはそのCFSに反応して菌糸を形成することが示されました。しかし、この反応はSaccharomyces cerevisiaeやCandida dubliniensisなどの他の酵母では誘導されませんでした30。さらに、この菌糸形成反応はC. albicansの研究用標準株であるSC5314のみに限定されず、臨床分離株WUM5Aを含む他のゲノム背景においても認められました30。本プロトコルでは、これらの知見に基づき、菌糸長、菌糸体積、および菌糸幅という3つの形態学的指標を定量化するための標準化されたワークフローを構築しました。さらに、これらの形態学的因子を用いて、倍数性の変動および接合型遺伝子座の状態が、分泌された誘導分子に反応するC. albicansの形態学的特性にどのように影響するかを評価しました。
ここで説明した非接触型の手法は、種を越えた可溶性シグナリング因子の形態計測的な結果を可視化および分析するためのシンプルな実験的枠組みを提供します。メンブレンインサートウェルプレートは、活性化した培養物間の双方向拡散を可能にする一方で、CFSベースのアッセイは、必要な誘導成分をダウンストリームの標的培養物とは独立して回収できるため、スケールアップ可能な形式となります。アッセイの整合性を維持するには、メンブレンインサートウェルプレートの設定において、約1:50（C. albicans対C. glabrata）の比率を維持する必要があります。この濃度勾配により、可溶性誘導分子がメンブレンバリアを越えて十分に流入することが保証されると同時に、ファルネソールなどの内因性クオラムセンシング阻害剤の蓄積閾値を下回ることができ、これによりC. albicansのフィラメント形成キネティクスの抑制を防ぐことができます31,32。同様に、CFSベースのアッセイにおける重要なステップは、C. glabrataのソース培養物が均一に定常成長期の後期に達するために必要な18時間の培養期間です。C. glabrata培養物の培養期間が12時間未満または24時間より長い場合、回収されたCFSに本研究で検討した特定の誘導分子が最適濃度で含まれている可能性が低くなり、菌糸誘導が不十分になります。CFSを回収するための適切な成長段階や培養物の比率は、新しい実験目的や新しい微生物種の組み合わせに合わせて標準化する必要があります。
異なる実験室環境においてアッセイの再現性を最大化するために、以下の主要な手順の改善を推奨します。すべての二倍体C. albicans株の overnight 培養には、グルコース最小培地 (GMM) の使用を推奨します。GMMの使用により、栄養豊富な YPD 培地で頻繁に見られるバックグラウンドの自動フィラメント形成が抑制されます。このような自動フィラメント形成は他の研究でも観察されていますが、その根本的なメカニズムはまだ解明されていません33。また、高倍率の明視野顕微鏡観察時に妨げとなる光散乱や光学収差を排除するため、画像取得前にポリカーボネート製メンブレンインサートを完全に物理的に除去することを推奨します。
これらの非接触構成は、可溶性シグナル伝達成分の役割を分離するのに役立ちますが、特有の実験上の課題があります。例えば、非接触アッセイでは、不適切な取り扱いによるメンブレンの破裂といった軽微なリスクが発生しやすく、その結果、微生物のクロスオーバーが起こる可能性があります。したがって、サンプリング時にピペットチップを配置する際は、チップがメンブレンではなくインサートのチャンバー壁に触れるよう注意を払う必要があります。さらに、不適切に（大きすぎる）孔径を選択すると、コンパートメント間で物理的な相互汚染が発生することがありますが、これは適切なメンブレン孔径を持つインサートを使用することで容易に解決できます。また、真菌の過剰増殖や広範なバイオフィルムの堆積により、多孔質メンブレンが覆われることがあります。これについては、初期接種量を OD600 = 0.1 に制限し、12 h を超えて培養しないことで対処します。加えて、微生物がデバイスのウェル内で均一に分布せず、メンブレン付近に凝集または付着することがあり、これが光学密度測定における予期せぬバイアスにつながる可能性があります。さらに、これらのシステムは2つの個体群を物理的に分離しているため、細胞同士の直接的な物理的接触に依存する相互作用を再現または評価することはできません。例えば、混合種のバイオフィルム成熟、機械的な共凝集、あるいは細胞壁に固定されたアドヘシンによるシグナル伝達などが挙げられます。これらのプレートベースのアッセイは、初期のフィラメント形成キネティクス（3 h 時点）のエンドポイント・スナップショットを効果的に提供しますが、長期的な増殖ダイナミクスや空間的挙動を捉えることはできません。長期間にわたる連続的なリアルタイム追跡を必要とする研究者には、特殊なマイクロ流体灌流チャネルや自動ライブセルイメージングチャンバーが、より適切な代替手段となる可能性があります。
細胞の幾何学的形状は代謝効率と根本的に結びついており、表面積対体積（SA/V）比が栄養獲得および細胞内輸送の主要な駆動要因となっています。二形性菌および糸状菌において、伸長した菌糸形態への移行は、最適化されたSA/V比を維持するための構造的適応として機能します。これにより、菌糸先端に向けられた代謝プロセスを維持しつつ、伸長した菌糸壁に沿って分散的に栄養を吸収することが可能になります34,35,36,37。しかし、本研究では、形態計測学的スケーリングが異なる倍数性状態や接合型遺伝子座の構成において一様に比例するわけではないことを示しています。
生成された形態計測データセット 〜経由で このトラッキングプロトコルにより、倍数性に相関した明確な構造的なスケーリング傾向が明らかになり、半数体系統は、すべての幾何学的指標において、対応する二倍体株よりも一貫して絶対値が小さいことが示された（図5）。二倍体背景において、ホモ接合体の MAT&#945;/&#945; この構成は、～と比較して、フィラメント形成の速度論（長さおよび体積）の向上を示した。 MATa/a または MATa/&#945; これらの条件下での菌株 in vitro 条件。フィラメント形成の亢進はしばしば浸透能の向上に関連しているが、臨床分離株においてなぜ C. albicans 主にヘテロ接合型の二倍体として単離される（MAT（マトリックス）a/&#945;）。免疫能を持つ宿主においては、ヘテロ接合状態にあることが、長期的な共生定着におけるより広範な適応度上の優位性をもたらしている可能性があります。言い換えれば、～の構造的特性が MATa/&#945; 形態型は、宿主の免疫監視に対する生存能が最適化されている。したがって、今後の研究では、これらの標準化された共培養系を活用し、さまざまな選択圧の下で異なる交配型ホモ接合体の相対的な適応度を系統的に評価すべきである。
先行研究により、液胞の形態、分裂・融合のダイナミクス、および構造的拡張が、伸長する真菌フィラメントの内部体積と膨圧の管理において重要な役割を果たすことが報告されています。例えば、いもち病菌Magnaporthe oryzaeでは、細長い栄養菌糸から球状の侵入構造への明確な移行が、液胞組織の変化と密接に連携しています38,39,40。しかし、本プロトコルではC. albicansのフィラメント形成における液胞ダイナミクスを直接的にモニタリングしていないため、これらの細胞内オルガネラの変化を全構造体積に関連付けて追跡することは、今後の研究における有益なアプローチとなります。さらに、真菌由来の特定のセクレトーム成分が、血清などの宿主由来の化学的誘導剤とは異なる形態学的スケーリングキネティクスを誘導する理由を解明するためのさらなる研究が求められます。
本プロトコルで詳述する非接触共培養法は、日和見細菌集団と二形性真菌との間のシグナル伝達ダイナミクスなど、種間およびドメイン間の相互作用を調査するために応用可能です。さらに、これらの96ウェルおよび24ウェル形式はスケールアップが可能であるため、この定量プラットフォームを化合物スクリーニングに利用できます。その例としては、基礎的な細胞生存率に直接影響を与えることなく、セクレトームによって刺激される菌糸形成経路を選択的に阻害する低分子阻害剤や新規抗真菌化合物の同定などが挙げられます。

自然環境や臨床における生態系において、微生物は通常、種内および&#160;種間&#160;コミュニケーションの複雑なネットワークによって制御された、構造的な多種微生物共同体の中に生息しています1。これらのコンソーシアムは、クオラムセンシング分子、揮発性有機化合物、分泌ペプチドやタンパク質を含む多様な化学信号を利用して、個体群レベルの行動を調整しています2。協調的、競争的、あるいは捕食的なニッチ相互作用は、微生物の代謝、空間的構造、およびストレス適応を著しく変化させるため、これらのコミュニケーションダイナミクスを明らかにすることは極めて重要です3。臨床的には、これらの多種微生物ネットワーク（細菌と真菌の2種混合、あるいは真菌同士の種間コンソーシアムなど）は、単一培養と比較して、相乗的な毒性、組織への定着の加速、および薬剤耐性の向上を示すことが頻繁にあります4,5。したがって、微生物間コミュニケーションの分子決定要因を解明することは、従来のモデルを超越し、コミュニティの安定性を崩す革新的な抗感染戦略を開発するために不可欠です6。
微生物間のクロストークの異なる様式を解析するために、研究者は主に哺乳類細胞生物学、免疫学、および腫瘍学で使用される多様な実験構成を利用しています7,8,9。例えば、直接接触共培養モデルは、&#160;ジャクスタクリン&#160;シグナル伝達および物理的な細胞間相互作用を調査するための標準的な手法として機能します10。同様の設定に修正を加えたものは、微生物間の物理的相互作用の研究や、微生物間の抑制または薬剤反応の理解にも使用されます9,11,12。しかし、接触依存性シグナルと拡散性シグナルの両方が観察される反応に寄与するため、根本的なメカニズムを区別することは困難です。従来の接触ベースのアッセイは空間的な知見を提供できますが、労力がかかり、かつ／または個別の菌株ラベル付けが必要であり、非モデル生物の場合、これは煩雑な作業となる可能性があります。対照的に、主に哺乳類の研究において、接触依存性シグナルと拡散性シグナルの寄与を区別するためにTranswell（メンブレンインサートウェルプレート）アッセイが使用されています13,14,15,16。この手法は、細胞間コミュニケーションが分泌分子によって媒介される場合に特に有用であり、細胞集団間のシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム分析を可能にします17。さらに、非接触アッセイは膜分離という利点があり、計算モデルを用いた実験と統合することで、従来の手法では見逃されていた微生物の動的な追跡を行うことも可能です18。このアプローチは、異なる細菌種の発育キネティクスを同時に研究するために時折使用されます19。
メンブレンインサートウェルプレートアッセイに代わる、より安価でハイスループットな手法が、無細胞上清（CFS）ベースまたは条件培地ベースのアッセイです。この手法は、幹細胞による組織修復や腫瘍誘発性血管新生を理解するために必要なセクレトームを単離する目的で、再生医療や血管生物学において用いられていることが知られています20。同様に、微生物研究においても、CFSの枠組みは多種微生物間の競合を解明するのに有用です。例えば、細菌濾液（&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;のアシルホモセリンラクトンや、&#160;Lactobacillus&#160;の代謝産物など）が、真菌バイオフィルムの成熟を調節するために使用されてきました21,22。&#160;より最近では、マイクロ流体プラットフォームにより、オルガンオンアチップ技術を通じて高精度な生理学的バイオミミクリーが可能になりました23,24。マイクロ流体システムは、微生物コミュニティのセクレトームに対する応答を同時に検出するために導入されていますが、専用の機器と専門知識が必要であり、あらゆる環境で容易に導入できるわけではありません25,26,27。したがって、多くの場合において、メンブレンインサートウェルプレートアッセイとCFSベースのアッセイが最適な手法になると期待されます。これら2つのアッセイの選択は、分泌分子の性質によって異なります。分泌分子が不安定である（すなわち、半減期が短い）場合や、リアルタイムの活性を測定する必要がある場合は、メンブレンインサートウェルプレートアッセイがより適しています。一方で、分泌分子が安定しており、実験が大規模である場合は、CFSベースのアッセイの方が経済的です。
本プロトコルの主な目的は、メンブレンインサートウェルプレートおよびCFSプラットフォームを用い、形態学的特性を評価するための定性的および定量的な追跡手法をステップバイステップで提示することである（図 1）。ここでは、例としてCandida albicansとCandida glabrataの間の分泌因子によるコミュニケーションを用いて実証している。さらに、これらのツールを用いて、分泌シグナル分子にさらされた際の&#160;C. albicans&#160;フィラメントの絶対的な幾何学的発達（長さ、体積、直径）を変化させる内在的な遺伝的変数（倍数性と接合遺伝子座の状態）の影響を定量化することも可能である。確立された本プロトコルは、種間シグナル伝達ダイナミクスの研究に適した、簡便で安価な非接触プラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES シリンジフィルター</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>寒天（Agar agar）</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 24ウェル キャリアプレート（セルカルチャーインサート付、0.4 &amp;mu;m）</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96ウェル マルチディッシュ（細胞培養処理済み、フラットボトム）</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>プロテオーゼペプトン</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>酵母窒素基（硫酸アンモニウム含有、アミノ酸不含）</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

真菌の種間相互作用における形態計測学的研究のための非接触共培養アッセイ

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

微生物コミュニティにおいて、細胞の挙動や形態は通常、さまざまな細胞内および細胞外因子によって影響を受けます。微生物間のコミュニケーションを研究するための既存のさまざまなアプローチは、煩雑であるか、あるいは特殊な設備や専門知識を必要とする場合があります。&#160;ここでは、相補的な2つの非接触共培養アプローチである、メンブレンインサートウェルプレート共培養アッセイと、無細胞上清（CFS）ベースのアッセイについて説明します。これらは、形態変化を測定可能な応答として利用し、特定の種間相互作用におけるさまざまな因子の役割を調査する手法です。メンブレンインサートウェルプレートシステムは、細胞外分子の拡散を許容しつつ、物理的に分離された種の間でリアルタイムの相互作用を可能にします。対照的に、CFSベースのアッセイは、コンディショニング培地に対する応答を評価するための、簡略化されスケールアップ可能なアプローチを提供します。本プロトコルには、培養準備、コンディショニング上清の作製、アッセイのセットアップ、顕微鏡観察、画像取得、Fijiを用いた定量的形態計測分析、および統計評価のための標準化された手順が含まれています。本手法は、内在的および外在的因子に対する真菌の形態応答の例を用いて実証されています。ここで提示する手法は、コミュニティにおける新しい微生物相互作用を研究するための、アクセシビリティが高く適応可能な代替ツールを提供し、コミュニティにおける多種共存の根底にあるメカニズムを調査するために容易に拡張できる可能性があります。

種間相互作用を探索するための非接触共培養アッセイ
水溶性で低濃度の細胞外シグナル分子は、混合微生物の共生における重要な通信イベントを媒介することが多い。このようなダイナミクスを評価するため、C. albicansとC. glabrataの間の相互作用パターンを分析しつつ、細胞同士の直接的な物理的接触を防止するように設計された、2つの非接触型細胞ベースの系を用いた。最初の構成では、組み込み膜インサートウェルプレート培養システムを利用し、2つの集団を不活性な0.4 µm多孔性ポリカーボネート膜で物理的に分離することで、障壁を越えた分泌分子の自由な双方向拡散を可能にした。2番目の系では、定常期のC. glabrata培養液から回収した細胞除去上清（CgCFS）を含むマイクロタイタープレート内で直接培養したC. albicans酵母細胞の増殖をモニタリングした。
以前のスクリーニング30と同様に、野生型ヘテロ接合性二倍体 C. albicans 細胞（SC5314）は、メンブレンインサート障壁で隔てられた C. glabrata 細胞、またはろ過済み CgCFS のいずれかに応答して、容易に真性菌糸を形成した。一方、純粋な陰性対照培地（GMMまたはYPD）で維持された細胞は、主に出芽酵母形態および偽菌糸形態のままであった（Figure 2A）。比較分析により、2つのアッセイ設定間で一貫性があることが示された。両アッセイにおいて、菌糸の長さ、体積、太さを含むすべての構造的指標で同等の値が得られた（Figure 2）。形態学的パラメータの差は、適切な統計検定およびそれに続く多重比較のためのポストホック検定による p 値が 0.05 の基準を満たした場合に有意であると見なした。これらの観察結果から、メンブレンインサートウェルプレート設定内での C. glabrata 細胞によって誘導された真性菌糸の長さ（39.66 µm ± 6.81 µm）と、ろ過済み CgCFS に曝露された場合の長さ（37.13 µm ± 6.50 µm）との間に、C. albicans 細胞において有意な差はないことが示された（Figure 2B）。同様に、メンブレンインサートウェルプレートシステムで誘導されたこれらの菌糸の体積（112.10 µm3± 22.59 µm3）も、CgCFS 条件培地における体積（109.78 µm3± 34.69 µm3）と有意な差は認められなかった（Figure 2C）。さらに、菌糸径の測定により、平均菌糸太さは2つの設定間で一貫していることが確認され、メンブレンインサートウェルプレート構成で 1.89 ± 0.10 µm、CgCFS 処理で 1.92 µm ± 0.23 µm という値であった（Figure 2D）。
倍数性と交配型構成がin vitroでの形態学的寸法を変化させる
倍数性のレベルおよび交配遺伝子座の構造が、二形態性転換を方向付ける役割を果たすことが、さまざまな真菌モデルシステムにおいて確立されています。本研究では、解析的な追跡パイプラインを適用し、一倍体（MATa または MATα）および二倍体（MATa/a、MATα/α、または MATa/α）の C. albicans 株のパネルにわたり、菌糸形成の指標、具体的には菌糸の長さ、構造体体積、太さ、および対応する母細胞の酵母細胞体積を定量化しました。
構造プロファイリングにより、誘導性のCgCFSセクレトームまたは陽性血清コントロールに曝露した際、ホモ接合型二倍体α株（MATα/α）は、ホモ接合型二倍体MATa/a株と比較して、有意に長い軸長（45.56 µm ± 9.24 µm および 46.62 µm ± 9.07 µm）と大きな体積（125.24 µm3 ± 39.94 µm3 および 119.45 µm3 ± 37.32 µm3）を持つフィラメントを形成することが明らかになった（Figure 3A,C）。C. albicansの標準的な臨床分離株は主にヘテロ接合型二倍体として存在するが、リファレンスMATa/α株は、誘導後（特に血清による誘導後）、MATa/a株に比べて長いフィラメントと大きな体積を示した。しかし、それらはホモ接合型MATα/α株よりも有意に小さかった（Figure 3B,D）。
同時に、半数体株では逆のパターンが示され、両方の誘導条件下において、半数体MATa株は半数体MATα株と比較して菌糸長が有意に増加しました（CgCFS：22.06 µm ± 5.41 µm 対 17.58 µm ± 4.12 µm、Serum：23.71 µm ± 6.59 µm 対 21.00 µm ± 5.29 µm；Figure 4A）。興味深いことに、半数体背景におけるこの長さの増加は、CgCFSに対する反応においてのみ、菌糸体積の増加（38.84 µm3 ± 19.58 µm3 対 34.25 µm3 ± 19.62 µm3）へと繋がりました（Figure 4B）。これらの初期のin vitro測定結果は、倍数性と接合型遺伝子座の構成との間に複雑な相互作用があることを示唆しており、MATaおよびMATα遺伝子座がフィラメント形成のダイナミクスにそれぞれ異なる寄与をしている可能性を示しています。
これらの統合データセットにおける構造的指標間の統計的関係を調べるため、試験したすべての倍数性と接合型バリアントを含む、Spearmanの順位相関（ρ）およびPearsonの線形回帰（R2）分析を行った。分析したすべてのペアにおいて正の相関が観察された：菌糸の長さと菌糸の体積、菌糸の長さと菌糸の太さ、菌糸の長さと母細胞の体積、および全菌糸体積と母酵母細胞の体積である（図5、補足表1および補足表2）。
菌糸の長さと算出された菌糸体積との間に最も強い相関が観察された（ρ = 0.91; Figure 5A）。対照的に、母酵母細胞の初期体積と突出した菌糸の体積との相関が最も弱かった（ρ = 0.63; Figure 5C）。さらに、菌糸の太さと菌糸の長さとの相関は、菌糸体積と菌糸の長さとの相関ほど強くなかった（Figure 5A,D）。母細胞の体積、菌糸の長さ、および菌糸の太さの相関において、統計的に有意な差は認められなかった（Figure 5B,D）。これらの幾何学的分布は、母酵母細胞の初期体積が大きいからといって、必ずしも菌糸が長くなったり体積が増加したりするわけではないことを示唆している。
要約すると、これらの結果は、物理的な接触を伴わずにC. albicansの形態形成の変化を可視化および定量化する上で、メンブレンインサートウェルプレートとCFSベースのアッセイの両方が有用であることを示しています。本プロトコルによって得られたデータは、異なる倍数性背景および接合型構成の間で異なる形態的特性があることを明らかにしています。これらの非接触アッセイ系は、多様な微生物の組み合わせにおける種間シグナル伝達ダイナミクスを調査するために適応可能な、柔軟で拡張性の高い手法を提供します。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
図1: メンブレンインサートウェルプレートを用いた共培養およびCFSによるCandida種の菌糸誘導アッセイの概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="図 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
図 2: メンブレンインサートウェルプレートとCFSベースの非接触アッセイの間で観察された菌糸形態の比較。 (A) YPD（コントロール）、メンブレンインサートウェルプレートセットアップ内での C. glabrata、または C. glabrata の細胞遊離上清（CFS）で調整した培地に対する C. albicans の形態的応答を示す代表的な明視野顕微鏡写真。ピンク、黒、白の矢印はそれぞれ酵母形、偽菌糸、真菌糸を示す。スケールバー、10 µm。メンブレンインサートウェルプレートセットアップ内での C. glabrata 細胞または C. glabrata CFSへの応答として観察された、ヘテロ接合型二倍体 C. albicans 株（SC5314）の菌糸長 (B)、菌糸体積 (C)、および菌糸厚 (D)。データは3回の独立した生物学的実験（n = 50細胞）における中央値 ± 95% 信頼区間を示す。ns、有意差なし: p &#62; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
図3: 二倍体 C. albicans において、接合型と接合性が菌糸形態に有意な影響を及ぼす。指定の誘導分子に対する応答における、C. albicans のホモ接合体二倍体間（A）およびヘテロ接合体とホモ接合体二倍体間（B）の菌糸長の比較を示すプロット。同様に、上述の誘導分子に対する応答における、ホモ接合体二倍体間（C）およびヘテロ接合体とホモ接合体二倍体間（D）の菌糸体積の比較を示す。コントロール：YPD（非菌糸誘導培地コントロール）。データは、n = 50 細胞、3回の独立した生物学的実験から得られた中央値 ± 95% 信頼区間を表す。プロット上部の数値は、ウィルコクソン順位和検定による比較で決定された p 値である。**: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001 は統計的に有意であり、ns は有意ではない（p &#62; 0.05）ことを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
図4半数体における菌糸の特性 C. albicans さまざまな分子誘導剤に対する応答として。 グラフは菌糸の長さ（A)および菌糸体積（B）に半数体における C. albicans 指示された誘導剤に応答した菌株。コントロール：YPD（非菌糸誘導培地コントロール）。データは中央値を表す。 &#177; 3回の独立した生物学的実験（n = 50細胞）からの95%信頼区間。示された数値は～を表す。 p-値は、ウィルコクソン順位和検定により算出。**: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001, 統計的に有意；ns, 有意差なし： p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="図 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
図 5: C. albicansの倍数性に相関する形態学的パラメータ間の相関。 プロットは、本研究で用いた形態学的パラメータ、すなわち、菌糸体積と菌糸長 (A)、細胞体積と菌糸長 (B)、細胞体積と菌糸体積 (C)、および菌糸厚と菌糸長 (D) の間のスピアマン相関および線形回帰を示している。ρ: スピアマン相関係数；R2: 線形回帰分析による決定係数；p: p値。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>菌株</td>
			<td>種</td>
			<td>倍数性</td>
			<td>遺伝子型</td>
			<td>翻訳対象のテキストをご提示ください。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>半数体 (1n)</td>
			<td>MAT（最小アロキノン濃度/最小抑制濃度などの文脈により異なりますが、一般的に生物学的・医学的文脈では）最小アロキノン濃度、または微量血液凝集試験（Microagglutination Test）&#945;</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>ヘテロ接合型（MATa/&#945;)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>ホモ接合体 (MATa/a); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Candida albicansにおけるバリア活性がフェロモン分解を媒介し、接合を促進する。Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>カンジダ・アルビカンス</td>
			<td>二倍体 (2n)</td>
			<td>ホモ接合体 (MAT&#945;/&#945;); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>カンジダ・アルビカンス</td>
			<td>半数体 (1n)</td>
			<td>ホモ接合体（MATa); ura3&#8710;::imm434 his4 gal1&#8710;::ura3&#8710;::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>半数体 (1n)</td>
			<td>ホモ接合体 (MAT&#945;); his4 ura3&#916;::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究で使用したCandida albicansおよびCandida glabrataの菌株。本表は、非接触型メンブレンインサートウェルプレート共培養および細胞遊離上清（CFS）ベースのアッセイで評価した真菌菌株の名称、明示的な遺伝子型、倍数性、および交配型の接合性をまとめたものである。
補足表 1： さまざまな C. albicans の形態学的パラメータに対して行われた統計分析のデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。</a>
付録表2： 本研究で評価したC. albicansの各種形態学的パラメータにおける、すべての生物学的レプリケートの生データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 1： 本研究で使用した培地の一覧およびその組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>

種間相互作用における真菌の形態学的応答を定性的および定量的に評価するための、2つの非接触共培養アプローチについて記述します。本プロトコルでは、Candidaの種間アッセイを例に、内因性因子が菌糸の成長にどのように影響するかを実演します。これらの手法は、多様な生物における微生物の種間コミュニケーションを調査するために容易に適応させることが可能です。

微生物コミュニティにおける細胞の挙動と形態は、通常、さまざまな細胞内および細胞外因子によって影響を受けます。さまざまなアプローチによって……

私たちは、宿主と病原体、および菌類間の種間相互作用における分子通信を研究しており、分泌シグナルが微生物の形態や行動をどのように形成するかを追究しています。既存の手法は、手間がかかったり、コストが高かったり、あるいは複雑であったりすることがあります。本プロトコールでは、新規の微生物種間相互作用を研究するための、シンプルで適応性が高く、非接触のアッセイ法を提案します。本プロトコールは、多様な生物学的および臨床的システムにわたる種間および界を越えた相互作用に関する、基礎的およびトランスレーショナルな研究を支援します。まず、Candida glabrata CBS 138のコロニーを含むグルコース最小培地（GMM）アガープレート、滅菌ループ、および滅菌酵母エキスペプトンデキストロース（YPD）ブイヨンを含むチューブをバイオセーフティーキャビネット内に配置します。プレートから単一の独立したコロニーをピックアップし、10 millilitersのYPDブイヨンに接種します。37 °Cで、200 rpmの連続撹拌下で18時間インキュベートします。オーバーナイト培養液を回収します。光学顕微鏡を用いて、酵母の形態およびコンタミネーションがないことを確認します。培養液を15-milliliterのコニカルチューブに移します。25 °Cで5,000 x g、5分間遠心分離します。上清を静かに除去し、細胞ペレットをメンブレンインサートアッセイ用に保存します。標的となるCandida albicans株については、二倍体株の場合は5 millilitersのGMMブイヨンに、一倍体株の場合はYPDブイヨンに単一コロニーを接種します。接種した培養液を37 °C、200 rpmの撹拌下で12時間インキュベートします。オーバーナイト培養液の600 nanometersにおける吸光度（OD）を確認します。次に、あらかじめ温めておいたGMMを用いて、最終容量が1 milliliter、最終 OD600が0.1となるように培養液を希釈します。滅菌済みの24ウェル組織培養プレートを用意します。選択したデュアルコンパートメント細胞培養プレートの下室（腹腔側）に、600 nmでのODが0.1のCandida albicans懸濁液を1 mLずつ加えます。次に、Candida glabrataペレットを回収し、1 mLのGMMブロスで再懸濁します。5,000 x gで3分間遠心分離し、上清を捨てます。この洗浄工程を2回繰り返します。最終的なペレットを新鮮なGMMブロスで再懸濁し、細胞懸濁液の600 nmでのODを5に調整します。次に、滅菌済みピンセットを用いて、孔径0.4 µmのポリカーボネート膜を備えた滅菌済みメンブレンインサートを各作業ウェルに配置します。インサートをウェルにしっかりと固定し、調製したCandida glabrata懸濁液を750 µLずつ上室（腔側）に分注します。組み立てたプレートに蓋をし、37 °Cで3時間、静置培養します。培養後、滅菌済みピンセットを用いて各上部インサートを取り除き、安全に廃棄します。形態評価を行うため、DIC光学系および10倍、20倍、そして超長作動距離の40倍対物レンズを備えた倒立顕微鏡に24ウェルプレートを設置します。規定のインキュベーション期間後、10倍対物レンズでウェル底面をスキャンし、細胞が均一に分布しているかを確認し、トラッキングエラーや異常な凝集がないかを特定します。コアとなるフィラメント数および個体群分布のデータセットを得るため、校正済みの20倍対物レンズを用いて、少なくとも10箇所の異なる視野を撮影します。詳細な表現型解析および細胞境界の測定には、超長作動距離の40倍対物レンズを使用してマイクログラフを撮影してください。その後、すべての生画像ファイルを保存します。最新バージョンのFijiソフトウェアを起動します。「File」から「Open」を選択し、対象のマイクログラフを開きます。菌糸の長さを測定するには、「Line selection」アイコンをクリックし、「Segmented line」ツールを選択します。フィラメントが母細胞の細胞壁から出ている接点にカーソルを置きます。菌糸の中心縦軸に沿ってトレースし、曲線や屈曲に合わせてアンカーポイントを追加しながら、先端（apical tip）まで辿ります。WindowsではControl + M、Mac OSではcommand + Mを使用して「measure」コマンドを実行し、結果（Results）ウィンドウに総延長Lをµm単位で記録します。「Brush」ツールを使用して測定済みの細胞にマークを付け、重複解析を防ぎます。それに付随する母細胞を特定します。「Segmented line」ツールを用いて、細胞の最大長軸に沿って直線を惹いて測定し、長軸Aを記録します。次に、長軸に垂直に、最も広い横断幅に沿って線を惹いて測定し、短軸Bを記録します。ソフトウェアに組み込まれている長球モデルを用いて、母細胞の体積CVをµm³単位で算出します。菌糸の太さを測定するには、「Segmented line」ツールを使用して、菌糸の長さ軸に垂直に外壁から外壁までの線を惹きます。フィラメントに沿って等間隔な3箇所で直径を記録します。これら3つの直径の算術平均を計算して平均太さdを求め、それを2で除して半径rを算出します。分枝のないフィラメントを円柱として扱い、菌糸の総体積HVをµm³単位で算出します。生物学的反復ごとの細胞測定値の平均値または中央値を算出し、これらの反復レベルの値を下流の統計比較に使用します。パラメトリック手法を適用する前に、Shapiro-Wilk検定またはD'Agostino-Pearson検定を用いて、生物学的反復データセットの正規性を評価します。2群間の比較において、データセットが正規分布に従う場合は、対応のない両側Studentのt検定を使用します。統計解析を行い、グラフ作成を完了した後、すべての図にわたって一貫した統計表記を適用してください。Candida albicans 細胞は、膜で分離された Candida glabrata 細胞、またはろ過済みの Candida glabrata 無細胞上清のいずれかに曝露された際、2つの非接触アッセイシステムにおいて真性菌糸を形成しました。一方、対照細胞は主に酵母形および偽菌糸形の形態を維持していました。膜分離共培養アッセイとろ過済み CFS アッセイの間に有意な差は認められず、いずれにおいても菌糸の長さ、体積、および太さは同等でした。本プロトコールでは、微生物コミュニティ内における種間シグナリングに対する形態学的応答を測定することにより、多種共存を調査することが可能になります。ここでの主な課題は膜を介した分子交換を確実にすることであり、これはプレートの攪拌および十分な静水圧の維持によって解決できます。オルガネラダイナミクスのライブセルイメージングにより、分子間コミュニケーションがどのようなメカニズムで種間相互作用を形成するかが明らかになると考えられます。

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