LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

本研究では、培養細胞および精巣などの天然組織においてRNAとタンパク質の相互作用を直接的にマッピングし、精子形成におけるTUG1の分子メカニズムを解明するためのUV架橋法であるcPDiRTを開発しました。このプロトコールにより、培養細胞から無傷の天然組織まで、より広範なシステムにおいてRNA-タンパク質相互作用の直接的なマッピングが可能になります。まず、GC2細胞をPBSで3回洗浄し、残留した培養液を除去します。

次に、ディッシュに3 mLのPBSを加え、クロスリンクを行う前に均一に分散させます。254 nmの紫外線クロスリンカーを用いて、4,000 mJ/cm²の線量で細胞を照射します。細胞をPBSで回収し、細胞懸濁液を4 °Cで3,000G、5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、ペレットの重量を量り、1サンプルあたり最低500 milligramsのペレット質量があることを確認します。4週齢のC57BL6雄マウスから精巣を採取します。外膜を除去した精巣組織を、5 to 10 millilitersのDMEMで2回洗浄します。

次に、100 mgの組織を、1 mg/mLのコラゲナーゼIVを含む10 mLのDMEMとともに37 °Cでインキュベートします。精細管が遊離するまで、5～15分間消化を続けます。その後、懸濁液を4 °Cで1000Gにて1分間遠心分離し、上清を除去します。

ペレットを5〜10 mLのDMEMで洗浄します。懸濁液を再び4°C、1000Gで1分間遠心分離します。そして、1 mg/mLのdeoxyribonuclease Iを含む0.25%trypsinでペレットを再懸濁します。懸濁液を37°Cで5〜15分間インキュベートします。

次に、酵素消化を停止させるため、10% FBSを添加したDMEMを同量加えます。懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。細胞を4°C、2000Gで5分間遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを5〜10 mLのPBSで洗浄します。懸濁液を再び4 °C、2000Gで5分間遠心分離します。単一細胞懸濁液をPBSで再懸濁し、15 cm培養ディッシュに均等に分注します。

GC2細胞で行った方法と同様に、精巣細胞を架橋します。コントロール細胞については、放射線照射を省略します。架橋した細胞を回収します。

懸濁液を4℃で3000Gにて5分間遠心分離し、上清を捨てます。少なくとも10〜12匹のマウスから単離した精巣細胞を合わせて、ペレットの質量を最低500mg確保してください。ペレットの重量を測定した後、ペレット100mgに対してバッファー1mLの割合で、細胞溶解バッファーに再懸濁します。

ボルテックス後、ライセートが視覚的に透明になるまで、集中超音波破砕機またはウォーターバス式ソニケーターを用いてサンプルをソニケーションします。その後、RNAおよびタンパク質分析用に、ライセート約10 µLをマイクロ遠心チューブに分注します。ライセートに、あらかじめ洗浄した磁気ビーズ 30 µLを添加します。

ハイブリダイゼーションオーブン内で、サンプルを37 °Cで30分間、緩やかに混合しながらインキュベートします。サンプルをマグネットスタンドに置き、約1分間、または溶液が透明になるまで静置します。透明になった溶解物を新しいチューブに移します。

新しいチューブをマグネチックスタンドに置きます。次に、残存するビーズを取り除くため、溶解物を別のチューブに移します。各サンプルに、37 °Cに調整したハイブリダイゼーションバッファーを2量分加えます。

100 µMのプローブストック液1 µLにつき溶解液1 mLの割合で、ビオチン標識DNAプローブを添加します。ハイブリダイゼーションオーブンを用い、サンプルを37 °Cで12〜16時間、エンドオーバーエンド回転させながらインキュベートします。使用直前に、100 µLのストレプトアビジン磁気ビーズを細胞溶解バッファーで3回洗浄します。

そして、最終洗浄後に残ったバッファーを除去します。ハイブリダイゼーション反応チューブを短時間遠心分離します。その後、ハイブリダイズさせたサンプルを洗浄済みのビーズに加え、穏やかに混ぜ合わせます。

ビーズ懸濁液を元のチューブに戻し、混合しながら37°Cで30〜40分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを短時間遠心分離します。チューブをマグネットスタンドに1〜2分間、または溶液が透明になるまで置きます。

次に、上清を捨てます。ビーズを洗浄するために、洗浄バッファーを1 mL加え、ハイブリダイゼーションオーブン内で37 °Cで5分間インキュベートします。5回洗浄した後、RNA解析用にビーズの1-10%を新しいチューブに移します。

最後に、残りのビーズに40 µLの1X SDSサンプルバッファーを加えます。サンプルを95 °Cで30分間沸騰させ、タンパク質を溶出し、架橋を解除します。下流の質量分析に用いるためにタンパク質を回収します。

ChIRP質量分析により、GC2細胞においてネガティブコントロールと比較して濃縮された190種類以上のタンパク質が同定されました。UV照射量 4,000 millijoules per square centimeterにおいて、cPDiRT-MSはより選択的なタンパク質セットを同定しました。これらのタンパク質の3分の2以上が、従来のChIRP-MSで同定されたものと重複していました。

少なくとも2つのユニークペプチドで同定されたほとんどのタンパク質は、GC2細胞とマウス精巣の両方において、生物学的レプリケート間で再現性高く検出されました。再現性良く同定されたタンパク質のジーンオントロジー解析の結果、TUG1の既知の機能と概ね一致する生物学的プロセスが明らかになりました。GC2細胞とマウス精巣のデータセットを比較したところ、共通して濃縮されていた15種類のタンパク質が同定されました。

強化されたクロスリンク免疫沈降シーケンシングにより、TUG1転写物上のPABPC1およびCCT3に対する明確かつ特異的な結合ピークが明らかになりました。cPDiRTを用いることで、研究者は培養細胞および生体組織の両方において、特定の結合RNAと直接相互作用するタンパク質を同定し、定量することが可能になります。最も重要な課題は、直接的なRNAとタンパク質の相互作用に対する高い特異性を確保しつつ、効率的なUVクロスリンクを実現することです。

本プロトコルは、この手法を他のRNAや組織に適用し、発生および生殖におけるダイレクトRNAプロテイン相互作用を解明するための今後の研究を支援します。