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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA Solution</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>組織の解離と単一細胞懸濁液の調製用</td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>RNAのクリーンアップ用</td></tr><tr><td>AffinityScript リバース トランスクリプターゼ</td><td>Agilent</td><td>600107</td><td>eCLIP cDNA合成用</td></tr><tr><td>Anti-CCT3 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab225878</td><td>eCLIP用抗体</td></tr><tr><td>Anti-PABPC1 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab312314</td><td>eCLIP用抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>RNA抽出用</td></tr><tr><td>コラーゲナーゼ タイプ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>精巣組織の酵素分解用</td></tr><tr><td>脱リン酸化試薬（T4 PNK）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>eCLIP RNAの脱リン酸化用</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース培地</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>細胞培養および組織解離バッファー用</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプタビジン C1 磁性ビーズ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>ビオチン化プローブ-RNA-タンパク質複合体の捕捉用</td></tr><tr><td>DynaMag-15 マグネット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12301D</td><td>磁性ビーズの分離用</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>磁性ビーズの分離用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>リシスおよび洗浄バッファー中の二価カチオンのキレート用</td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼ I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td>eCLIP cDNAの精製用</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>トリプシン消化の停止用</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td>ハイブリダイゼーションバッファー調製用</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>TUOHE</td><td>LF-I</td><td>プローブのハイブリダイゼーションとビーズの洗浄用</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>eCLIP ライブラリサイズ選択用</td></tr><tr><td>MinElute Gel 抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>eCLIP ライブラリサイズ選択用</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini キット</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA精製用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>高塩洗浄バッファー調製用</td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜</td><td>GE Healthcare / Amersham</td><td>10600002</td><td>eCLIP ウェスタンブロット転写用</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85125</td><td>洗浄バッファー洗剤用</td></tr><tr><td>核酸分解酵素およびプロテアーゼフリー水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td>核酸分解酵素フリー溶液の調製用</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris ゲル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td>eCLIP サイズ選択用</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris プレキャストゲル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>SDS-PAGE タンパク質分離用</td></tr><tr><td>PBS（pH 7.4）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>細胞の洗浄と再懸濁用</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニル フッ化物（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>セルリシスバッファーのセリンプロテアーゼ阻害剤；使用前に新鮮に添加</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>セルリシスバッファーの広域プロテアーゼ阻害剤；使用前に新鮮に添加</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850</td><td>RNA抽出におけるタンパク質消化用</td></tr><tr><td>qRT-PCR マスターミックス</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11704044</td><td>RNA濃縮を確認するための定量的RT-PCR用</td></tr><tr><td>RNase/プロテアーゼフリー DNase I 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td>組織の解離用</td></tr><tr><td>RNeasy Mini キット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA精製用</td></tr><tr><td>SDS-PAGE サンプルローディングバッファー</td><td>Beyotime</td><td>P0286</td><td>タンパク質サンプル調製用</td></tr><tr><td>エビアルカリホスファターゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>eCLIP cDNA精製用</td></tr><tr><td>シルバー ステインキット</td><td>Beyotime</td><td>P00175</td><td>SDS-PAGE ゲルにおけるタンパク質の可視化用</td></tr><tr><td>ナトリウムデオキシコール酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>洗浄バッファー洗剤用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>セルリシスとタンパク質変性用</td></tr><tr><td>Superase-in RNase インヒビター</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>特殊RNase インヒビター；使用前に新鮮に添加</td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>eCLIP アダプターのライゲーション用</td></tr><tr><td>Tris＆ndash;HCl（pH 7.0）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>リシス、ハイブリダイゼーション、および洗浄バッファーの調製用</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026CN</td><td>RNA抽出用</td></tr><tr><td>超音波細胞破砕機</td><td>ATPIO</td><td>ATPIO-650D</td><td>細胞リシスとDNA断片化用</td></tr><tr><td>紫外線架橋装置</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP CL-1000</td><td>RNA-タンパク質相互作用をUV架橋用</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>膜上でのeCLIPタンパク質分解用</td></tr></tbody></table>

lncrnaと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのuvベースのchirp法:培養細胞からマウス精巣まで

A UV-Based ChIRP Method For The Verifiable Identification of Proteins That Directly Interact With LncRNA: From Cultured Cells To Mouse Testis

LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as important regulators of diverse biological processes. However, the molecular mechanisms underlying the ...

本研究では、培養細胞および精巣などの天然組織においてRNAとタンパク質の相互作用を直接的にマッピングし、精子形成におけるTUG1の分子メカニズムを解明するためのUV架橋法であるcPDiRTを開発しました。このプロトコールにより、培養細胞から無傷の天然組織まで、より広範なシステムにおいてRNA-タンパク質相互作用の直接的なマッピングが可能になります。まず、GC2細胞をPBSで3回洗浄し、残留した培養液を除去します。次に、ディッシュに3 mLのPBSを加え、クロスリンクを行う前に均一に分散させます。254 nmの紫外線クロスリンカーを用いて、4,000 mJ/cm²の線量で細胞を照射します。細胞をPBSで回収し、細胞懸濁液を4 °Cで3,000G、5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットの重量を量り、1サンプルあたり最低500 milligramsのペレット質量があることを確認します。4週齢のC57BL6雄マウスから精巣を採取します。外膜を除去した精巣組織を、5 to 10 millilitersのDMEMで2回洗浄します。次に、100 mgの組織を、1 mg/mLのコラゲナーゼIVを含む10 mLのDMEMとともに37 °Cでインキュベートします。精細管が遊離するまで、5～15分間消化を続けます。その後、懸濁液を4 °Cで1000Gにて1分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットを5〜10 mLのDMEMで洗浄します。懸濁液を再び4°C、1000Gで1分間遠心分離します。そして、1 mg/mLのdeoxyribonuclease Iを含む0.25%trypsinでペレットを再懸濁します。懸濁液を37°Cで5〜15分間インキュベートします。次に、酵素消化を停止させるため、10% FBSを添加したDMEMを同量加えます。懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。細胞を4°C、2000Gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを5〜10 mLのPBSで洗浄します。懸濁液を再び4 °C、2000Gで5分間遠心分離します。単一細胞懸濁液をPBSで再懸濁し、15 cm培養ディッシュに均等に分注します。GC2細胞で行った方法と同様に、精巣細胞を架橋します。コントロール細胞については、放射線照射を省略します。架橋した細胞を回収します。懸濁液を4℃で3000Gにて5分間遠心分離し、上清を捨てます。少なくとも10〜12匹のマウスから単離した精巣細胞を合わせて、ペレットの質量を最低500mg確保してください。ペレットの重量を測定した後、ペレット100mgに対してバッファー1mLの割合で、細胞溶解バッファーに再懸濁します。ボルテックス後、ライセートが視覚的に透明になるまで、集中超音波破砕機またはウォーターバス式ソニケーターを用いてサンプルをソニケーションします。その後、RNAおよびタンパク質分析用に、ライセート約10 µLをマイクロ遠心チューブに分注します。ライセートに、あらかじめ洗浄した磁気ビーズ 30 µLを添加します。ハイブリダイゼーションオーブン内で、サンプルを37 °Cで30分間、緩やかに混合しながらインキュベートします。サンプルをマグネットスタンドに置き、約1分間、または溶液が透明になるまで静置します。透明になった溶解物を新しいチューブに移します。新しいチューブをマグネチックスタンドに置きます。次に、残存するビーズを取り除くため、溶解物を別のチューブに移します。各サンプルに、37 °Cに調整したハイブリダイゼーションバッファーを2量分加えます。100 µMのプローブストック液1 µLにつき溶解液1 mLの割合で、ビオチン標識DNAプローブを添加します。ハイブリダイゼーションオーブンを用い、サンプルを37 °Cで12〜16時間、エンドオーバーエンド回転させながらインキュベートします。使用直前に、100 µLのストレプトアビジン磁気ビーズを細胞溶解バッファーで3回洗浄します。そして、最終洗浄後に残ったバッファーを除去します。ハイブリダイゼーション反応チューブを短時間遠心分離します。その後、ハイブリダイズさせたサンプルを洗浄済みのビーズに加え、穏やかに混ぜ合わせます。ビーズ懸濁液を元のチューブに戻し、混合しながら37°Cで30〜40分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを短時間遠心分離します。チューブをマグネットスタンドに1〜2分間、または溶液が透明になるまで置きます。次に、上清を捨てます。ビーズを洗浄するために、洗浄バッファーを1 mL加え、ハイブリダイゼーションオーブン内で37 °Cで5分間インキュベートします。5回洗浄した後、RNA解析用にビーズの1-10%を新しいチューブに移します。最後に、残りのビーズに40 µLの1X SDSサンプルバッファーを加えます。サンプルを95 °Cで30分間沸騰させ、タンパク質を溶出し、架橋を解除します。下流の質量分析に用いるためにタンパク質を回収します。ChIRP質量分析により、GC2細胞においてネガティブコントロールと比較して濃縮された190種類以上のタンパク質が同定されました。UV照射量 4,000 millijoules per square centimeterにおいて、cPDiRT-MSはより選択的なタンパク質セットを同定しました。これらのタンパク質の3分の2以上が、従来のChIRP-MSで同定されたものと重複していました。少なくとも2つのユニークペプチドで同定されたほとんどのタンパク質は、GC2細胞とマウス精巣の両方において、生物学的レプリケート間で再現性高く検出されました。再現性良く同定されたタンパク質のジーンオントロジー解析の結果、TUG1の既知の機能と概ね一致する生物学的プロセスが明らかになりました。GC2細胞とマウス精巣のデータセットを比較したところ、共通して濃縮されていた15種類のタンパク質が同定されました。強化されたクロスリンク免疫沈降シーケンシングにより、TUG1転写物上のPABPC1およびCCT3に対する明確かつ特異的な結合ピークが明らかになりました。cPDiRTを用いることで、研究者は培養細胞および生体組織の両方において、特定の結合RNAと直接相互作用するタンパク質を同定し、定量することが可能になります。最も重要な課題は、直接的なRNAとタンパク質の相互作用に対する高い特異性を確保しつつ、効率的なUVクロスリンクを実現することです。本プロトコルは、この手法を他のRNAや組織に適用し、発生および生殖におけるダイレクトRNAプロテイン相互作用を解明するための今後の研究を支援します。

a-uv-based-chirp-method-for-verifiable-identification-proteins-that

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

RIP-チップを介したRNA関連した複合体を単離および同定するためのステップバイステップのプロトコル。...

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

Chirpが長い非コードRNAのゲノム結合部位（lncRNAs）をマッピングするための新規かつ迅速な手法である。メソッドは、lncRNAバインドされたゲノムサイトの列挙を許可するアンチセンスタイルオリゴヌクレオチドの特異性を利用しています。...

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

私たちは、真と偽のタンパク質 -...

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

このビデオは、マウス精巣のRNA結合タンパク質を同定するための強化された架橋免疫沈降法(eCLIP)を実演しています。eCLIPは、RNA結合タンパク質(RBP)が標的RNAと相互作用する結合部位の正確な同定を可能にします。...

マウス精巣におけるタンパク質結合RNAの効率的な同定のための強化された架橋免疫沈降法

タンパク質相互作用：SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。...

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。...

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。...

LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

この RNA プルダウン法は、長い非コード RNA (lncRNA) の RNA ターゲットを識別することができます。自家製、設計されたアンチセンス DNA のオリゴヌクレオチドのプローブ適切に固定ティッシュまたは細胞のこの lncRNA に固有の交配に基づいて、それは効率的に、lncRNA のすべての RNA...

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

ここでは、精巣での RBP 候補の主要な RNA 標的を決定するための eCLIP...

マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法

Nanjing Medical University.  LNNa-タンパク質の直接的な相互作用を特定するためのUVベースのChIRP法。

LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

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