部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術の原理

こんにちは、フランク・ブーフホルツです。私はマックス・プランク分子細胞生物学・遺伝学研究所でグループリーダーを務めています。私たちの研究は継続的に行われています。

私たちの研究には2つの側面があります。一つはRNA Iスクリーニングに関するものであり、もう一つは高度なゲノム編集のための部位特異的組み換え酵素の開発に関するものです。

私の経歴についてですが、私は生物学者、分子生物学者であり、生物学の基礎を学びました。その後、ハイデルベルクの欧州分子生物学研究所（EMBL）で博士号を取得し、サンフランシスコのカリフォルニア大学サンフランシスコ校（UCSF）のマイク・ビショップの研究室で、白血病の動物モデルに関するポストドクター研究に従事しました。ここドレスデンのマックス・プランク研究所では、発生生物学と細胞生物学という、少なくとも2つの異なる側面を融合させようとしています。基本的には、細胞がいかにして組織を形成するかを理解しようとすることが、彼らの根幹となるテーマであると考えています。

それが基本的に、ここストンの研究所の全体的な目標です。私たちは主に2つの分野に取り組んでいます。一つの分野はRNAiスクリーンを行い、生物学的プロセスにおける、これまで機能が未解明であった遺伝子の新しい機能を特定しようとするものです。

もう一方は、部位特異的組み換え酵素を用いてゲノムの高度な編集を可能にする技術の開発を目指したゲノムエンジニアリングに関するものです。部位特異的組み換え酵素が発見されたのは、例えば我々が使用しているCre組み換え酵素などの場合、1980年代初頭でした。これは実際には細菌性ファージタンパク質であり、もともとは細菌に感染するウイルスである細菌性ファージに由来しています。

したがって、現在使用されているものとは大きく異なりますが、これらの酵素が他の生物においても利用可能な非常に興味深い機能を果たせることが急速に認識されるようになりました。部位特異的組み換え酵素はDNAに結合するタンパク質であり、DNAの特定の配列に特異的に結合します。そして、これらの標的配列に結合すると、DNAを切断し、さらに部位を再配置することで、基本的にライゲーションのプロセスも同時に行います。つまり、この部位特異的組み換えを用いることで、いわば「ハサミと糊」のように、以前は組み合わさっていなかった方法でDNA配列を再構成させることが可能です。

このように、前述のサイト特異的組換え酵素は、もともと細菌またはバクテリオファージで発見されましたが、その後、他の生物でも機能するかどうかが検証されました。そして興味深いことに、これらの酵素は他の生物においてもその機能を果たしました。

したがって、例えば、生物に組み込んだ部位特異的組み換え酵素の標的部位がある場合、これらの酵素はその機能を果たします。これらの部位特異的組み換え酵素、特に、本日お話ししている研究の出発点として使用したflip組み換え酵素やCre組み換え酵素のように、補因子を必要としないものの利用は非常に顕著です。これらは補因子なしで機能します。

例えば、これらを動物、あるいは動物の細胞内で発現させた場合、この生物内で認識可能な配列を見つけ出し、そこで基本的にカット・アンド・ペーストを行い、特定の配列を切り出すことができます。そのため、この酵素は、例えばマウスのいわゆる条件付き変異導入において非常にうまく利用されてきました。ある遺伝子が興味深いものであることが分かっており、その遺伝子の機能を知りたい場合を考えてみましょう。

非常に著名な実験の一つに、いわゆるノックアウトマウスの作製があります。最近ご覧になった方もいるかと思いますが、マウスにおいて基本的に遺伝子欠損を行うこの技術には、実は今年、ノーベル賞が授与されました。しかし、動物の遺伝子をノックアウトした際、それが必須遺伝子であるために、マウスが胚発生の非常に早い段階で死亡することがあります。

これで、あなたの遺伝子が非常に重要であることはわかりますが、具体的にどのような機能を持っているかまではわかりません。そのため、今日非常に一般的な手法は、いわゆる条件付きノックアウトを行うことです。具体的には、目的の遺伝子の両端を、これらの部位特異的組換え酵素の標的部位で挟み込みます。

つまり、これらのマウスでは、遺伝子が野生型マウスと同様に発現することを意味します。しかし、ここで、例えば組織特異的プロモーターの下でCREリコンビナーゼを発現するマウスとこれらのマウスを交配させれば、リコンビナーゼの発現場所に基づいてあらかじめ定義した特定の細胞においてのみ、目的の遺伝子を欠損させることができます。また、これらの実験から、こうした組換えによって個体全体から配列を非常に効率的に除去できることが分かっています。

そして、これが私たちが考えた、あらかじめ定義した部位で切断するリコンビナーゼの開発というアイデアの前提条件となりました。これまで、部位特異的リコンビナーゼをさらに発展させる上での大きな制限の一つは、使用したい生物の細胞ゲノムに認識標的部位をエンジニアリングして組み込む必要があったことでした。そこで私たちは、この障壁を打破できるのではないかと考えました。

基本的には分子進化を利用しています。私の知る限り、現時点では部位特異的リコンビナーゼは治療に使用されていません。前述した通り、それは主に、自然界に存在するどのリコンビナーゼによっても認識される標的部位が、ヒトの体内に存在しないためです。

そのため、まずは変更を加え、治療現場で使用可能にする必要があります。現時点では、それがそもそも可能かどうかの極めて初期の段階にあります。したがって、これらの酵素を治療目的で開発できるかどうか、またそれが本当に可能かどうかは、今後の経過を見る必要があります。