Name: AAVS1におけるドキシサイクリン誘導性ASCL1/DLX2発現を用いたヒト誘導多能性幹細胞からのGABA作動性ニューロンの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶ CRISPR/Cas9を用いたAAVS1座へのASCL1/DLX2ノックインとドキシサイクリン誘導系によるヒトiPS細胞からのGABA作動性ニューロン効率的分化法。この確実なプロトコルは神経疾患モデリングに有用です。

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	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
	<li>Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.</li>
	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
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	<li>Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.</li>
	<li>Gu J, Rollo B, Liu Z, O&#8217;Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.</li>
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<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1002B</td><td>hiPSCの電気穿孔/核内導入用。</td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>サルステッド</td><td>83.3920300</td><td>hiPSCの維持および分化のための組織培養処理済みプレート。</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。</td></tr><tr><td>セルカウンター (Countess)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10283</td><td>細胞計数用。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>セルペレタイズ用。</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Heracell VIOS 160iまたは同等</td><td>37 &deg;C、加湿雰囲気、および5% CO2を維持する細胞培養インキュベーター。</td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5000-0020</td><td>hiPSCの凍結用無菌クライオバイアル。同等の外ねじ1.8&ndash;2.0 mLクライオバイアルを使用可。</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>プロトコルで使用する標準的なBMEコーティングマトリックス。Bio-Techneの分析証明書からロット固有のストック濃度を確認し、DMEM/F-12に80 &micro;g/mLの使用濃度で希釈。</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>BMEを希釈する際の基礎培地。</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D2650</td><td>凍結培地の調製に使用する凍結保護剤。</td></tr><tr><td>ドナープラスミド: 誘導性ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1ターゲティングカセット</td><td>カスタムプラスミド</td><td>Addgene アクセスは保留中</td><td>ドキシサイクリン誘導性ASCL1-P2A-DLX2カセットおよび選択/レポーター要素を含むカスタムAAVS1ドナープラスミド。プラスミドマップと完全な配列を補足ファイルとして、または要求に応じて提供。</td></tr><tr><td>ドキシサイクリンハイクレート</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9891</td><td>ASCL1-P2A-DLX2発現を誘導するために使用。無菌ストック溶液を調製し、分液し、光から保護し、凍結保存し、最終濃度1 &micro;g/mLで使用。</td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td>商業アルコール / グリーンフィールドグローバル</td><td>P016EAAN</td><td>生物安全キャビネット内の滅菌用。認可された70%エタノールまたは同等品を使用。</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>レポーター発現と神経形態学の位相差および蛍光イメージングに使用する顕微鏡。</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。</td></tr><tr><td>hiPSCラインPGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1ヒトiPSCライン</td><td>このプロトコルで使用する商業的に入手可能なオープンコンセントヒトiPSCライン。編集および分化の前に通過番号とQCステータスを記録。</td></tr><tr><td>イメージ分析ソフトウェア</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>オープンソース。使用するバージョンを報告すべき</td><td>蛍光定量および代表的な画像処理用。</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Replacement (KOSR)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10828028</td><td>凍結培地の調製に使用。</td></tr><tr><td>ラミニン-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>オプションのトラブルシューティング試薬のみ。標準コーティングプロトコルの部分ではない。神経細胞の剥離が持続する場合、代替または二重コーティングマトリックスとして使用可。</td></tr><tr><td>液体窒素デュワー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Locator 6 Plusまたは同等</td><td>機関のクライオジェニック安全手順に従って、蒸気相または液体窒素で凍結されたhiPSCの長期保存。</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Freezing Container</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5100-0001</td><td>-80 &deg;Cで細胞の制御速度凍結用。</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>hiPSCのフィードフリー維持培地。</td></tr><tr><td>ニューロ誘導培地</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>初期神経誘導に使用する商業的ニューロ誘導培地。</td></tr><tr><td>ニューロ成熟ベース培地 (BrainPhys&trade; Neuronal Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>神経成熟のためのベース培地。BDNF、GDNF、NT-3、ドキシサイクリン、およびPluriSln-1をプロトコルに記載されている通りに補充。</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotrophic Factor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>神経成熟のための組換えヒトタンパク質。製造元の指示に従って調製し、最終濃度10 ng/mLで使用。</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>ロンザ</td><td>V4XP-3024</td><td>hiPSC核内導入用ソリューションP3とキュービットを含むキット。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>細菌汚染リスクを低減するオプションの抗生物質。</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade;予防薬</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>マイコプラズマ汚染を防ぐオプションの抗生物質。</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>未分化hiPSCを除去するための多能性細胞生存阻害剤。製造元の指示に従ってストックを調製し、最終濃度20 &micro;Mで使用。</td></tr><tr><td>プアロマイシンジヒドロクロリド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1113803</td><td>選択に使用する抗生物質。無菌ストック溶液を調製し、分液し、凍結保存し、キルカーブで最終使用濃度を決定（通常0.4&ndash;0.6 &micro;g/mL）。</td></tr><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNAプラスミド</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>AAVS1ターゲティングに使用するCRISPR/Cas9プラスミド。AAVS1 gRNAシーケンスをプラスミドマップまたは補足情報に含める。</td></tr><tr><td>qPCR分析ソフトウェア</td><td>Applied Biosystems / サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Quant

aavs1におけるドキシサイクリン誘導性ascl1/dlx2発現を用いたヒト誘導多能性幹細胞からのgaba作動性ニューロンの生成

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

AAVS1におけるドキシサイクリン誘導性ASCL1/DLX2発現を用いたヒト誘導多能性幹細胞からのGABA作動性ニューロンの生成

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

本研究では、ヒトの神経細胞の多様性と疾患をモデル化するため、hiPSCから純粋なGABA作動性ニューロン集団を生成することに焦点を当てています。既存のプロトコルでは、分化させるたびに繰り返しのウイルス導入が必要でした。本プロトコルでは、AAVS1細胞株を用いることでこの制限を解消しています。まず、50 mLのコニカルチューブに、40 mLのノックアウト血清代替物（KOSR）と10 mLのDMSOを混合して凍結保存液を調製します。ピペッティングを10回繰り返し、凍結保存液を均一に混ぜた後、溶液を4 °Cで保存します。次に、基底膜抽出物（BME）をDMEM/F12培地で希釈し、最終濃度を80 µg/mLにします。希釈したBMEを6ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ加えます。プレートを傾けて溶液をウェル表面全体に均等に広げ、コーティングされていない箇所がないようにし、プレートを37 °Cで最低30分間インキュベートします。アスピレーティングピペットを使用して、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むウェルから培地を吸引します。ウェルに1 milliliterのReLeSRを加え、室温で30秒間インキュベートします。解離試薬を吸引し、プレートを37 degrees Celsiusで8分間インキュベートします。5-milliliterピペットを使用して、1 milliliterのhiPSC維持培地をウェルに静かに加えます。細胞懸濁液を50-milliliterチューブに回収します。マイクロ遠心チューブ内で、細胞懸濁液10 microlitersとトリパンブルー10 microlitersを混合します。混合液10 microlitersを細胞計数用スライドにロードし、生存細胞濃度を測定します。あらかじめ準備しておいたウェルからBMEコーティングを吸引した後、Rho関連キネシン快的コイルドコイルキナーゼ（ROCK）阻害剤を添加したhiPSC維持培地2 millilitersを加えます。生存率90%以上のhiPSCs 100,000個をウェルに播種します。細胞が均一に分布するようにプレートを8の字状に動かし、37 degrees Celsius、5% carbon dioxideの条件下でインキュベートします。24時間後、培地をROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR plus培地2 millilitersに交換します。コンフルエンスが約60%に達した時点で細胞を継代します。ニュークレオフェクション装置の電源を入れ、ニュークレオフェクション溶液P3にニュークレオフェクションサプリメントを添加します。氷上に置いたマイクロ遠心チューブに、ニュークレオフェクション溶液P3を110 µL加えます。次に、CRISPR/Cas9プラスミド 1 µgとドナープラスミド 1 µgをチ

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転​​写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc -...

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

このビデオは、胚様体(EB)を神経上皮凝集体に分化させ、その後のニューロン細胞とグリア細胞への分裂のプロセスを示しています。この方法により、in...

ヒト人工多能性幹細胞由来胚様体からのニューロンおよびグリア細胞の生成

このビデオでは、テトラサイクリン応答性エレメントの制御下で神経原性転写因子遺伝子を保有する遺伝子操作レンチウイルスをトランスフェクションすることにより、ヒト多能性幹細胞をニューロンに分化誘導し、その後、テトラサイクリン誘導体および成熟培地で処理するプロセスを示しています。...

人工レンチウイルスを用いたニューロンにおけるヒト多能性幹細胞分化

この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。...

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。...

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。...

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

神経変性におけるニューロンとグリアの相互作用は、ツールや方法が不十分なため、よく理解されていません。ここでは、ヒト多能性幹細胞から誘導されたニューロン、希突起膠細胞前駆細胞、および希突起膠細胞を取得するための最適化されたプロトコルについて説明し、アルツハイマー病における細胞種特異的な寄与を理解する上でのこれらの方法の価値の例を提供します。...

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

ニューロンプログラミングによって生成されたヒト多能性幹細胞由来のGABA作動性ニューロンの移植は、神経発達障害の潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。このプロトコルは、ヒト幹細胞由来のGABA作動性ニューロン前駆体の生成と新生児マウスの脳への移植を記述しており、移植されたニューロンの長期的な調査とその治療可能性の評価を可能にします。...

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

学ぶ CRISPR/Cas9を用いたAAVS1座へのASCL1/DLX2ノックインとドキシサイクリン誘導系によるヒトiPS細胞からのGABA作動性ニューロン効率的分化法。この確実なプロトコルは神経疾患モデリングに有用です。

AAVS1におけるドキシサイクリン誘導性ASCL1/DLX2発現を用いたヒト誘導多能性幹細胞からのGABA作動性ニューロンの生成

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