Name: DNA-FISHメタフェーズは、ヒトがん細胞株の染色体外DNAと均一染色領域を区別するために広がります (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-04T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぼう、DNA-FISHメタフェーズ法を用いてヒトがん細胞株の染色体外DNAと均一染色領域を区別する方法。単一細胞解像度で遺伝子増幅状態を可視化し、がんゲノミクス研究に応用できます。

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dna-fishメタフェーズは、ヒトがん細胞株の染色体外dnaと均一染色領域を区別するために広がります

DNA-FISH Metaphase Spreads to Distinguish Extrachromosomal DNA from Homogeneously Staining Regions in Human Cancer Cell Lines

DNA-FISHメタフェーズは、ヒトがん細胞株の染色体外DNAと均一染色領域を区別するために広がります

Whole-genome sequencing identifies focal DNA amplifications with base-pair resolution but cannot determine whether amplified sequences reside on ...

本研究では、増幅したオンコジーンが染色体外DNA（ecDNA）上に存在するのか、あるいは染色体内に統合された独立した均質染色領域（HSR）内に存在するのかを判定することに焦点を当てています。シーケンシングではecDNAとHSRによる増幅を区別できないため、本プロトコルではこれを単一細胞レベルの解像度で解決します。まず、Colcemidストック溶液を滅菌超純水で1対1の比率で希釈します。中期停止させるため、対数増殖期にあり、コンフルエンスが70%から90%の状態である10 mLの培地で維持されたCOLO320DM細胞に、希釈したColcemid溶液を100 µL添加し、細胞培養インキュベーターで45分から一晩置きます。メタノールと酢酸を3対1の比率で混合し、新鮮なCarnoy固定液を調製します。固定操作の間、Carnoy固定液は常に氷上で保持してください。新鮮な0.075 M塩化カリウム溶液を調製し、37 °Cのウォーターバスで加温します。遠心分離と細胞計数後、PBSで細胞を洗浄します。加温した0.075 M塩化カリウム溶液10 mLで穏やかに再懸濁し、緩やかな転倒混和によって懸濁液を混ぜ合わせます。細胞を37 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。転倒混和で懸濁液を穏やかに混ぜながら、氷冷したCarnoy固定液2 mLをゆっくりと加えます。細胞を5分間静置した後、室温で500 gで5分間遠心分離します。ピペットを用いて上清を慎重に除きます。氷冷したCarnoy固定液10 mLを、0.5 mLずつゆっくりと加え、各添加後に懸濁液を穏やかに混ぜ合わせ、細胞を10分間静置します。室温で650 gで5分間遠心分離します。最終洗浄後、細胞はCarnoy固定液に懸濁したままにします。ガラススライドにラベルを貼り、氷上に置きます。P1000ピペットを使用して、細胞をCarnoy固定液を用いて1mLあたり約500万細胞の濃度で再懸濁します。固定した細胞懸濁液を約300 µL、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。P200ピペットを用いて、ピペッティングを数回繰り返し、サンプルを十分に再懸濁します。再懸濁した細胞を60 µL吸引し、氷上のガラススライドから約1 m上の高さでピペットチップを保持し、スライドの中央を狙います。細胞懸濁液をスライド上にゆっくりと滴下します。スライドを80 °Cのスライドインキュベーターに10分間置きます。10倍または20倍の対物レンズを備えた位相差顕微鏡を用いてスライドを観察します。重なりが少なく、十分に分散した複数の中期分裂像が存在することを確認します。スライドの前処理として、ガラススライドを70% 酢酸に2分間浸します。40 mLのPBSで30秒間洗浄し、続いて45 mLのPBSで5分間、2回目の洗浄を行います。次に、ガラス

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