Name: Drosophila melanogasterにおけるDR-whiteアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶDR-whiteアッセイによるDrosophila melanogasterのDNA二本鎖切断修復機構。相同組換え、非同源末端結合、一本鎖アニーリングを区別し、組織特異的な修復経路の解析に応用可能です。

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本手法は、J.R.L.がAmerican Federation for Aging Research（米国老化研究連盟）のAFAR研究助成金を受給していた間に開発されました。&#160;また、本研究は米国国立総合医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）からJ.R.L.への助成（1R15GM110454および1R15GM129628）によって支援されました。図はBioRender（https://BioRender.com/b8sbcjp）2026の支援を受けて作成されました。

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著者らに開示すべき金銭的または非金銭的な利益相反はありません。

DR-whiteシステムの汎用性は、DNA修復分野における過去および将来の影響に寄与する重要な要因である。第一に、DR-whiteレポーター構築物内のattB統合配列により、研究者はDrosophilaゲノム内の多数の部位にレポーターを標的化することができ21、すでにいくつかの標的化系統が利用可能である22。第二に、hsp70プロモーターによる熱ショック発現（本研究）、ubiquitinプロモーターによる構成的発現23、およびBamプロモーターによる減数分裂前生殖細胞系発現24など、異なるI-SceIトランスジェンの利用可能性により、DSB修復を探索するための多くの発生段階および組織特異的なコンテキストが提供される。使用する&#160;I-SceIトランスジェンに関わらず、適切なDSB誘導を確実にするため、I-SceIトランスジェンが最終交配でのみ導入されるよう、遺伝的交配を慎重に計画しなければならない。修復頻度は、DR-whiteのゲノム上の位置および/または使用したI-SceI&#160;トランスジェンによって大きく異なる可能性があることに注意することが重要である。今後の実験では、ゲノム上の位置とI-SceIトランスジェンをさらに比較することで、ゲノムのコンテキストまたは組織特異性のどちらがDSB修復を駆動しているかを決定できる可能性がある。
DR-whiteアッセイおよびその派生系の特筆すべき利点は、相同組換え、プロセシングを伴うNHEJ、そして多くの場合においてSSAによるDSBの修復を同定できることです。本システムは表現型的に生殖細胞系列の修復イベントを検出するように設計されていますが、TIDEアルゴリズム解析を用いることで体細胞組織の解析も可能です。これらの利点がある一方で、本アッセイには考慮すべきいくつかの制限事項があります。特に、DR-whiteアッセイはHRの頻度を過小評価する可能性があります。ヌクレアーゼ誘発DSBを利用する他の遺伝的リポーターアッセイと同様に、姉妹染色分体からのHRによる修復（姉妹間HR）は、DSBが発生しなかったイベントやプロセシングのないNHEJと区別がつきません。したがって、「No DSB/NHEJ」クラスの一部には、少なくともいくつかのHRイベントが含まれている可能性があります。この制限を考慮すると、遺伝的要因（変異株など）を比較した結果の解釈には注意が必要です。本アッセイのその他の制限としては、生存可能な子孫を残さなかった減数分裂前のイベントをスコア付けできないことが挙げられます。例えば、修復されずに細胞死に至ったDSBイベントは、子孫においてスコア付けされません。全体的な受精能が生殖細胞死の定性的指標となり得ますが、細胞ベースのアッセイ（TUNELなど）が必要になる場合があります。さらに、TIDE Rスクリプト解析では、細胞集団における検出可能なイベントの割合しか提供されません。具体的なindel配列の結果を決定するには、マルチプレックスDNAシーケンシングを用いた個々の修復イベントのシーケンシングが必要です。
DR-whiteアッセイは、DSB修復の研究においてすでに多大な影響を与えています。この手法の適用により、年齢25、性別26、DSBの位置22,26、ドナー配列の位置15、細胞周期、および組織型26を含む、多細胞生物におけるDSB修復に寄与する因子の特定が進んできました。さらに、本アッセイを用いて、Msh627、Blm28、Rif116、CtIP16,29など、Drosophilaにおける修復経路の選択や、分岐した配列の修復を促進するいくつかのタンパク質を同定しました。実際に、保存されたDNA修復タンパク質を持つ遺伝学的なモデル生物としてDrosophilaが確立されていることは、複雑な生物学的コンテキストにおけるDSB修復に寄与する遺伝的、細胞的、および個体レベルの因子を調査するための簡便な多細胞システムを提供しています。

ゲノムの完全性はしばしばDNA損傷によって脅かされますが、その中でも二本鎖切断（DSB）は特に毒性が高いものです。これらの切断が未修復のままであると、遺伝情報の喪失、染色体再編成、および細胞死につながる可能性があります1。そのため、細胞はDSBを修復するための複数の経路を進化させてきました。非相同末端結合（NHEJ）はDSBの両末端を直接結紮しますが、切断部位にインデル（挿入・欠失）が導入される可能性があります。単鎖&#160;アニーリング（SSA）は、切断部位に隣接する相補的配列を利用して修復を行うため、切断部位に欠失が生じます。一方、相同組換え（HR）は相同配列を修復のテンプレートとして利用します2,3。
歴史的に、DSB修復の研究は、生化学的アッセイ4や、細菌5,6、酵母7,8、哺乳類細胞培養9,10などの単細胞系に限られてきました。これらのモデルは、主要な修復タンパク質とそのメカニズムを特定する上で極めて重要でしたが、多細胞生物が持つ生物学的な複雑さは欠けていました。Drosophila melanogasterは、DNA修復を研究するための多細胞モデルシステムとして普及しています。しかし、現在の多くのアッセイは、特定の修復経路に特化していたり11、Pエレメント除去のような大規模な染色体異常を利用していたり12、あるいは時間のかかる分子解析を必要としていたりします13。DR-whiteアッセイは、DrosophilaにおけるDNA修復の簡便な遺伝的レポーターを提供することで、これらの課題を解決します14。本研究では、確立されたDR-whiteアッセイを用いてDNA DSB修復を測定するための、遺伝学的および分子生物学的アッセイを行うための完全で実用的かつ詳細なステップバイステップのワークフローを提供します。
このアッセイでは、～の2つのダイレクトリピートを用います。 キイロショウジョウバエ 白 (w) 遺伝子は、野生型の赤色眼を規定する（図1）。どちらのコピーも機能していません。1つ目は、 Sce.white、野生型SacI部位にI-SceIメガヌクレアーゼ認識配列を持つ挿入断片を含み、未成熟終止コドンを導入しているもの。2つ目は、 iwhiteは、5'末端と3'末端の両方が切断されており、HR修復のテンプレートとして機能します。A ショウジョウバエ 黄色 導入遺伝子 (y+）、野生型の茶色の体色を付与するこれが2つの間に存在し 白 リピート。DR-白 カセットが～に組み込まれています。 y w 変異体背景、DR-白 ショウジョウバエは表現型として、体色が野生型の褐色で、眼が変異型の白色である。
DR-white系統のハエとI-SceIトランスジーンを保持するハエを掛け合わせることで、Sce.white部位にDSBを誘導できます。減数分裂前の生殖細胞におけるDSBの修復は、テスター交配の後代をスコアリングすることで測定可能です。NHEJによる修復は、親世代の褐色の体色と白色の眼という表現型をもたらし（Figure 1A）、HRによる修復は野生型のwhite配列を復元し、褐色の体色と赤色の眼を持つ後代をもたらします（Figure 1B）。DSBのSSA修復または有糸分裂交叉は、間に挟まれたyellowトランスジーンの消失を引き起こし、結果として黄色の体色と白色の眼を持つハエとなります（Figure 1C）。体細胞における修復結果を解析するため、我々はTracking Indels by DEcomposition (TIDE) アルゴリズムを適応させ、特にDR-whiteアッセイにおけるプロセシングを伴うNHEJおよびHR修復を検出できるようにしました15,16
DR-whiteアッセイは、Drosophilaにおいて以前に確立されたDNA修復アッセイよりもいくつかの利点があります。断裂が生殖細胞系で生成および修復されるため、修復結果を表現型解析によって容易に検出できます。同時に、このアッセイは非常に汎用性が高いのが特徴です。主にHR修復の測定を目的として設計されていますが、3つすべての修復経路を検出することが可能です。さらに、機能的な2種類の追加修復テンプレートも開発しました（図2）。iwhite.muテンプレートには28個のサイレント一塩基多型（SNP）が含まれており、赤色の目の子孫を産出させるため（図2A）、遺伝子変換領域（GCT）の長さや、分岐した配列間でのHR修復の研究を容易にします14。&#160;iwhiteΔ9テンプレートは、野生型のSacI部位に9塩基対の欠失を持っており、オレンジ色の目の子孫を産出させます（図2B）。この特徴により、研究者は異なるテンプレートからのHR修復を追跡することができ、これはDR-whiteアッセイ独自の機能です15。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL RNase/DNaseフリーペッスル</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>gDNA抽出のための試料の均質化に</td></tr><tr><td>脱脂綿</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>標準的なショウジョウバエ飼育用</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ用ペルチェ式冷却インキュベーター</td><td>シェル研究室</td><td>SRI6PF</td><td>標準的なショウジョウバエ飼育用</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ系統：y[1] w[1]</td><td>ブルーミントン・ショウジョウバエ&amp;nbsp; ストックセンター</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ系統：y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque研究室</td><td>該当なし</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centerから入手したストックRRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2])を、LaRocque labが標準的な組換えによって作製。責任著者に請求することで入手可能。</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ系統：y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque研究室</td><td>入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。</td><td>ストックRRID:BDSC_24482（y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP）に組み込まれたDR-whiteアッセイ&amp;rsquo;}ZH-51C）；責任著者への請求により提供可能</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ系統：y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque研究室</td><td>該当なし</td><td>ストックRRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP)に組み込まれたDR-white.muアッセイ&amp;rsquo;}ZH-51C）；責任著者に請求することで入手可能</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ系統：y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque研究室</td><td>該当なし</td><td>iwhite&amp;Delta;9個のドナーをストックRRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP})に組み込んだ&amp;rsquo;}ZH-51C）；責任著者への請求により提供可能</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ用Flugsボトルキャップ</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>標準的なショウジョウバエの飼育用</td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡 (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>標準的なショウジョウバエ（Drosophila）用 &quot;フライプッシング&quot; および蛍光に基づく分取</td></tr><tr><td>FlyStuff ショウジョウバエ用フライパッド</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>標準的なショウジョウバエ用 &quot;フライプッシング&quot;</td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MyBath 4L ウォーターバス</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>〜のために&amp;nbsp; ヒートショック</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>DNA定量用</td></tr><tr><td>Nutri-fly Bloomington処方培地</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>標準的なショウジョウバエ飼育用</td></tr><tr><td>ペレットペッスル式コードレスモーターホモジナイザー</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>gDNA抽出のための試料ホモジナイズに使用</td></tr><tr><td>ポリプロピレンボトル</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>標準的なショウジョウバエ培養用</td></tr><tr><td>ポリスチレン製バイアル</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>ヒートショックを含む標準的なショウジョウバエの飼育法</td></tr><tr><td>プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_8f</td><td>該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分である。</td><td>該当なし</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_8a</td><td>該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分である。</td><td>該当なし</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_9f</td><td>該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分です。</td><td>提供されたソーステキストがございません。翻訳対象のテキストをご提示ください。</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>仮説を立てる</td><td>バージョン 2023.06.1+524</td><td>無料でダウンロード可能なバージョン。R Studioはどのバージョンでも使用可能であるが、提示されたデータは以下のバージョンを用いて解析された。&amp;nbsp; バージョン 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>R Studioパッケージ：Biostrings</td><td>Bioconductor.org (バージョン 3.24)</td><td>バージョン 2.76.0</td><td>Rスクリプトが、このパッケージをインストールするようユーザーに促します。</td></tr><tr><td>R Studioパッケージ：sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (バージョン 3.24)</td><td>バージョン 1.44.0</td><td>Rスクリプトにより、ユーザーにこのパッケージのインストールを促します。</td></tr><tr><td>SapphireAMP 高速 PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>標準的なショウジョウバエ（Drosophila）用 &quot;フライプッシング&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV GelおよびPCRクリーンアップ&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogasterにおけるdr-whiteアッセイを用いたdna二本鎖切断修復の測定

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

DNA二本鎖切断（DSB）修復に関する従来の研究は、生化学的な調査や単細胞系（細胞や酵母など）に限定されることが多い。多細胞生物におけるDSB修復の研究を促進するため、我々はDrosophila melanogasterにおいてDR-whiteアッセイを用いる。DR-whiteアッセイは、単一のI-SceI認識配列を保持するシンプルかつ汎用性の高いDSB修復リポーターアッセイであり、I-SceIメガヌクレアーゼの発現によって切断される。I-SceIの発現は、構成的、熱ショック経由、または他のプロモーター下で誘導でき、組織特異的あるいは発生段階特異的な修復の調査が可能である。本アッセイの主な利点は、相同組換え（HR）、非相同末端結合（NHEJ）、および単鎖アニーリング（SSA）に関与する修復結果を区別できる点にある。本記事では、確立されたDR-whiteアッセイの詳細なプロトコルを提供し、減数分裂前の生殖細胞系列においてDSBを誘導し、後代のスコアリングによって修復イベントを表現型的に解析するためのステップバイステップのワークフローを説明する。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、シーケンシング、およびTracking of Indels by DEcomposition（TIDE）Rスクリプトによる修復イベントの分子解析についても記述する。本プロトコルは、個体モデルにおけるDNA修復の遺伝学的および分子的なメカニズムを調査するための有用なツールとなる。

ショウジョウバエ 相同組換えによる修復におけるRad51の必要性
生殖細胞系列の実験が成功すると、図 3A に示す期待通りの表現型クラスが得られ、1バイアルあたり少なくとも20匹のスコア可能な子孫が得られます。予期しない表現型が得られた場合や、スコア可能な子孫が20匹未満である場合は、コンタミネーションまたは生産性の不足を示しており、ステップ 1.4.3 の指定に従い除外する必要があります。TIDE解析において、成功したサンプルでは約 1.7 kb のアンプリコンが生成され、ブレイクサイト前のバックグラウンドがほとんどないクロマトグラムが得られます。収量が低い、またはコンタミネーションしたDNA、およびノイズの多いクロマトグラムは最適ではなく、解析に使用すべきではありません。
熱ショック誘導性I-SceI源を用いたDR-whiteアッセイにおいて、野生型ショウジョウバエにおけるHR修復の頻度は38.5 ± 1.2%（平均 ± SEM）である一方、SSAは約3.2 ± 0.35%で発生する（Figure 3B&#160;および Supplemental File 4）。Rad51（DrosophilaにおけるホモログspnAによってコードされる）は、相同組換えのストランド侵入ステップに必要である14,19。したがって、Rad51の欠損はHRの効率低下をもたらすと考えられる。実際に、DmRad51-/-背景では、HR修復は1.3 ± 0.4%まで減少し、それに伴いSSA修復が増加する（34.5 ± 1.8%; Figure 3B&#160;および Supplemental File 4）14。これは、相同組換えに割り当てられた修復イベントが、代わりにwhite反復配列のシングルストランドアニーリングによって修復されたためである可能性が極めて高い。
Drosophila の CtIP が体細胞組織における効率的な HR 修復に果たす役割
TIDEアルゴリズムを用いることで、体細胞における修復経路の選択を測定することが可能になります。非変異背景において、検出可能な修復イベントのうち、プロセシングを伴うNHEJが59.0%、HRが41.0%の割合で発生します（図4B&#160;および 補足ファイル4）。CtIPは、DNA末端削り込みを促進することで、HR修復の開始において重要な役割を果たしています。20したがって、ある DmCtIP-/- 背景として、体細胞におけるHR経路の選択は、ヘテロ接合体コントロールの41.0%からホモ接合体変異体の10.9%へと著しく減少しており（図4B および 補足ファイル 4)16。これは、～において...であることを示唆している。 ショウジョウバエCtIPはHR修復に寄与するが、不可欠ではない。
<img alt="図 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
図 1: DR-white DSB レポーターアッセイと修復結果。 Direct Repeat of white アッセイには、機能を持たない 2 つの white 遺伝子コピーが含まれている：Sce.white（I-SceI 認識部位を含む 23-bp の挿入があり、早期終止コドンが導入されている）および iwhite（5′ および 3′ 端が切断されたドナー配列）。DR-white と I-SceI 導入遺伝子を持つショウジョウバエを交配させると、部位特異的な DSB が生じ、これを表現型または分子生物学的に解析できる。得られる表現型は、(A) 白い目の後代（y+ w−）で、DSB がないか、姉妹染色分体間 HR または NHEJ が起こったことを示す、(B) 赤い目の後代（y+ w+）で、iwhite ドナーから野生型 SacI 配列を復元する染色体内 HR が起こったことを示す、および (C) 黄色の体と白い目の後代（y− w−）で、SSA または有糸分裂 CO が起こったことを示す。図は Do et al. 14 より改変。略語：CO = crossover（乗り換え）；DR-white = Direct Repeat of white；DSB = double-strand break（二本鎖切断）；HR = homologous recombination（相同組換え）；NHEJ = nonhomologous end joining（非相同末端結合）；SSA = single-strand annealing（一本鎖アニーリング）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
図2: DR-誘導体白 アッセイ (A) DR-white.mu アッセイには、～に28個のサイレントSNPが含まれています。 iwhite.mu ドナー配列により、ダイレクトリピート間に1.4%の配列多様性が生じる。個々の多型に関する遺伝子変換は、相同組換え（HR）イベントごとに異なり、シーケンシングによって決定できる。BDR-白 ～を用いて（または、～とともに） iwhite&#916;9つのドナーにより、相同染色体間組換えと染色体内組換えを区別する。染色体内からのHR（相同組換え）。 iwhite ドナーが野生型を回復させる SacI 配列であり、赤目の子孫を生じさせる。相同染色体間からの相同組換え（HR） iwhite&#916;9番目のドナーは、9 bpの欠失により減少するため、オレンジ色の眼を持つ子孫を産生する。 白 発現。図はDoらによるものを改変。14 および Fernandez らは15略語：DSB = 二本鎖切断、HR = 相同組換え、SNP = 一塩基多型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
図3: 前減数分裂期生殖細胞におけるDSB修復結果を検出するための実験ワークフロー。(A) 交配1では、DR-whiteレポーター（またはその誘導体）とI-SceIトランスジェネ（この例では第2染色体上）を組み合わせます。DR-whiteアッセイとI-SceIトランスジェネの両方を保持する子世代は、その生殖細胞および体細胞組織に修復イベントを維持します。前減数分裂期生殖細胞における個々の修復イベントを解析するため、両方のトランスジェネを持つ子世代をy wテスターショウジョウバエと交配させ（交配2）、図1に記載の方法で子世代をスコアリングします。(B) 野生型ショウジョウバエ（n = 106 生殖細胞）およびDmRad51ホモ接合体変異体（n = 46 生殖細胞）における個々の生殖細胞DSB修復イベント。**P &#60; 0.01; ****P &#60; 0.0001（二元配置分散分析後、Sidakの多重比較検定による）。バーは平均値を、エラーバーはSEMを表します。データはDo et al.14から再解析したものです。略語：ANOVA = 分散分析; CO = 乗り換え（クロスオーバー）; DSB = 二本鎖切断; HR = 相同組換え; NHEJ = 非相同末端結合; SEM = 平均標準誤差; SSA = 単一鎖アニーリング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
図4: TIDE（Tracking of Indels by DEcomposition）を用いたDSB修復結果検出の実験ワークフロー。(A>) DR-whiteおよび誘導されたI-SceIトランスジェーンを保持するショウジョウバエを、gDNA抽出、DSB部位をまたぐPCR増幅、サンガーシーケンシング、およびRスクリプトを用いたTIDE解析により分析する。(B>) DmCtIP-/-&#160;変異体（n = 23）およびDmCtIP+/-&#160;ヘテロ接合体コントロール（n = 31）の代表的なデータ。検出可能な修復イベントは、DSBなしまたはインデルを伴わないNHEJを除外し、HRおよびプロセッシングを伴うNHEJの合計として算出する。****P &#60; 0.0001（二元配置分散分析後、Sidakの多重比較検定を実施）。バーは平均値を、エラーバーはSEMを示す。データはThomasら16から再解析したものである。略語：ANOVA = 分散分析; DSB = 二本鎖切断; gDNA = ゲノムDNA; HR = 相同組換え; NHEJ = 非相同末端結合; PCR = ポリメラーゼ連鎖反応; SEM = 平均標準誤差; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1： no-DSBコントロールに対するシーケンスクロマトグラム中の挿入および欠失を同定するためのTIDE Rスクリプト。ユーザーが編集可能なコントロールファイル名、サンプルファイル名、およびI-SceIターゲット配列は、スクリプトの終端付近に記載されています。必要な入力、出力ファイル、および解釈については、セクション2.3に記載されています。sangerseqRおよびBiostringsパッケージが必要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 2： TIDE R スクリプトワークフローのステップバイステップ・スクリーンショットガイド。これらのパネルは、セクション 2.3 で説明されているソフトウェア操作を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 3： TIDE出力例および修復イベントの計算。 0-indel の値は、DSBが発生しなかったか、またはインデルを伴わない NHEJ を表します。個別の HR 行は、標準的な 23-bp 欠失産物を表します。その他のすべてのインデル割合は、「プロセシングを伴う NHEJ」として合計されます。検出可能な総修復量は、HR とプロセシングを伴う NHEJ の合計として計算されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 4： 図3Bおよび図4Bの根拠となる生データ（編集可能な個別のワークシートに整理されています）。これらのデータは、対応する図の説明文で引用されている既報の研究から再解析したものです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。</a>

DR-whiteアッセイは、多細胞生物であるDrosophila melanogasterにおけるDNA二本鎖切断修復の結果を検出するための汎用性の高い遺伝子レポーターアッセイです。

Drosophila melanogasterにおけるDR-whiteアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復の測定

DNA二本鎖切断（DSB）修復に関する従来の研究は、生化学的な調査や単細胞システム（例：細胞、...）に限定されていることが多く、

当研究室では、ゲノム完全性の分野に関心を持っており、細胞がどのようにDNA二本鎖断裂を修復するかに焦点を当てています。他のDNA修復アッセイとは異なり、Drosophila DR-whiteアッセイでは、体細胞および生殖細胞を含む多細胞コンテキストにおける二本鎖断裂修復を測定できます。遺伝的交配と二本鎖切断の誘導が完了した後、テスター交配の子世代が羽化するまで待機します。最初のハエが出現した時点から、約9日間にわたって子世代のスコアリングを行います。二酸化炭素を用いてハエを麻酔するか、餌のない空のバイアルにハエを移し、-20 °Cで少なくとも30分間凍結させます。ハエをフライパッド上に置きます。スコアリングにあたり、RFP蛍光を用いて、whiteのダイレクトリピートまたはDR-whiteカセットを持つハエを特定します。眼および体の色をスコアリングしてください。DR-whiteカセットにリンクしたy-plusトランスジェンは、完全な野生型ではない中間的な茶色の体色を呈します。これらのハエを、DR-white染色体を欠くRFP陰性のyellow white子世代と比較することで、二本鎖切断なしまたは非相同末端結合を、単鎖アニーリングから区別します。より濃い茶色の体を持つハエは、二本鎖切断なしまたは非相同末端結合として分類してください。データセットには、少なくとも20匹のハエをスコアリングしたバイアルのみを含めてください。修復イベントの分子解析を行うため、「交配1」の子世代と同様に、DR-whiteおよびI-SceIの両方のトランスジェーンを持つ熱ショック処理済みのハエを回収します。個々のハエを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、ドライアイスとエタノールの混合浴でサンプルを急速凍結させます。電動ホモジナイザーを用い、各サンプルを50 µLのバッファーAでホモジナイズします。その後、サンプルを65 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。各サンプルに100 µLのバッファーBを加え、チューブを反転させて軽く混ぜ合わせます。サンプルを氷上で少なくとも30分間インキュベートし、その後、4 °Cで約16,000 gにて15分間遠心分離します。沈殿物が混入しないように注意しながら、清澄な上清125 µLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。100 µLのイソプロパノールを加え、チューブを反転させて軽く混ぜ合わせます。室温で約16,000 gにて10分間遠心分離します。DNAペレットを乱さないように注意して、上清を吸引除去します。氷冷した70%エタノール250 µLでペレットを洗浄し、チューブを反転させて静かに混ぜ合わせます。4 °Cで約16,000 gにて5分間遠心分離し、再度上清を吸引除去します。ペレットを乾燥させすぎないように注意しながら、チューブのキャップを開けたまま室温に置き、残留エタノールを蒸発させます。その後、20 µLのヌクレアーゼフリー水を加え、4 °Cで一晩置いてペレットを再溶解させます。翌日、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせ、DNA濃度を測定します。100 nanogramsのゲノムDNAとDR- white前方および後方プライマーを用い、PCRによりSce.white領域を増幅させる。I-SceIトランスジェニックを欠損したDR- whiteコントロールショウジョウバエのゲノムDNAを加え、適切なサイクル条件で反応を行う。PCR産物を約2 microliters、1% Tris-acetate-EDTAゲルで電気泳動し、Sce.whiteの増幅を確認する。アンプリコンが約1.7 kilobasesであることを確認し、Sce.whiteアンプリコンを精製する。DNA濃度を測定し、DR- whiteシーケンシングプライマーを用いて精製したPCR産物をシーケンシングする。必要なRパッケージをダウンロードした後、シーケンスクロマトグラムを確認し、切断部位の前にバックグラウンドがほとんどまたは全くないもののみを解析用に選択します。拡張子が.ab1のシーケンストレースファイルをダウンロードします。それらすべてをコンピュータ上の1つのフォルダにまとめ、シーケンスのファイル名を可能な限り簡素化してください。RStudio統合開発環境で、Tracking of Indels by DEcomposition（TIED）Rスクリプトを開きます。ソースペインでcontrolで始まる行を探し、保存したコントロールシーケンスのファイル名を、拡張子を含めて引用符で囲んで正確に入力します。sample nameで始まる行を探し、括弧内に各サンプルのシーケンスファイル名を、それぞれ個別の引用符で囲み、カンマで区切って入力します。次に、編集したTIED Rスクリプトを、解析対象のシーケンスと同じフォルダに保存します。統合開発環境の出力ペインにあるFilesタブを使用して、TIEDフォルダに移動します。Moreドロップダウンをクリックし、Open New Terminal Hereを選択します。新しく開いたターミナルにRと入力し、Enterキーを押します。Rが起動したら、sourceコマンドにスクリプトファイル名を添えて入力し、Enterキーを押してTIED Rスクリプトを実行します。このスクリプトにより、グラフィカルな表現と、各サンプルの生データを含むカンマ区切り値ファイル（CSVファイル）が生成されます。各CSVファイルを開き、生データをサンプルシーケンスにおけるindelの割合として解釈します。最後に、出力の下部に個別に報告される標準的な23塩基対欠失を、相同組換え値として特定します。0 indelの値は、二本鎖切断がないか、またはindelを伴わない非相同末端結合として解釈し、残りのindel値の合計を、プロセシングを伴う非相同末端結合として決定します。生殖細胞系列を用いた実験が成功し、期待通りの表現型クラスが得られ、1バイアルあたり少なくとも20匹のスコア可能な後代が確認された。熱ショック誘導性I-SceIを発現する野生型ショウジョウバエでは、後代の約38.5%で相同組換えが起こったのに対し、シングルストランドアニーリング（SSA）は3.2%であった。DmRad51ホモ接合体変異体背景では、相同組換えによる修復は約1.3%に減少し、それに伴いSSA修復は約34.5%に増加した。非変異体背景の体細胞では、検出可能な修復イベントの約59%をプロセシングを伴う非相同末端結合が占め、相同組換えは41%であった。DmCtIPホモ接合体変異体背景では、相同組換え経路の選択率は10.9%に低下した。このプロトコルは、修復に影響を与える因子を特定するために、さまざまな組織、発生段階、およびゲノム領域に適用することが可能です。さらに、本アッセイは、遺伝子変換トラックの長さや修復テンプレートの優先度などの修復結果を測定するために改変されています。このDNA修復アッセイを用いることで、ショウジョウバエの遺伝的変異体を用いて、修復に関与するさまざまな因子を特定することができます。

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

この記事では、GFPベースの蛍光を示して...

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

このビデオでは、ヒト単核細胞のDNA二本鎖切断部位に局在する特定のDNA損傷応答タンパク質を検出する免疫蛍光顕微鏡法について説明します。タンパク質は特定の一次抗体によって認識され、その抗体は蛍光色素でタグ付けされた二次抗体に結合し、顕微鏡での可視化中に蛍光を発するため、タンパク質を細胞核内の明確な蛍光病巣として可視化することができます。...

DNA二本鎖切断の分析のための免疫蛍光顕微鏡

非常に後期ショウジョウバエの胚の胚性表皮は、急速な刺し傷応答解析のためのin vivoのシステムを提供し、哺乳動物モデルへの変換のための創傷治癒の研究を進めるために遺伝子操作や化学マイクロインジェクションの治療と組み合わせることができます。...

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。...

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

このプロトコルは、胚から成人まで、あらゆる発達段階でのショウジョウバエの生存率を評価するように設計されています。この方法は、異なる種型または成長条件の生存率を決定し、比較するために使用することができる。...

ショウジョウバエメラノガスターの胚から成人への生存率を評価する直接的かつ簡単な方法

血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。...

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。...

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。...

GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。...

ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

学ぶDR-whiteアッセイによるDrosophila melanogasterのDNA二本鎖切断修復機構。相同組換え、非同源末端結合、一本鎖アニーリングを区別し、組織特異的な修復経路の解析に応用可能です。

Drosophila melanogasterにおけるDR-whiteアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復の測定

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