Name: Aedes albopictusの解剖および解剖後組織からの全RNA抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-30T17:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ、Aedes albopictusの中腸・唾液腺・卵巣の解剖法と高品質全RNA抽出プロトコル。この標準化手法は蚊媒介感染症研究における遺伝子発現解析を支援し、再現性のあるデータ取得を可能にする。

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本研究では、飼育下の&#160;Ae. albopictus&#160;のみを使用しました。したがって、本研究において施設内の倫理承認は不要でした。本実験で使用した&#160;Ae. albopictus&#160;系統は、中国国家衛生健康委員会寄生虫病制御・予防重点研究室（江蘇省）より提供されました。このコロニーは、もともと1980年代に無錫市で採集され、&#160;Jiangsu Institute of Parasitic Diseases&#160;の昆虫飼育室にて標準条件下で維持されていました。蚊のコロニーは、温度 25 °C ± 1 °C、相対湿度 75% ± 5%、明期 10 h・暗期 14 h の光周期に設定された人工気象室で飼育しました。幼虫は超純水中で飼育し、豚肝臓粉末と酵母エキス（Shanghai Brewery）を 2:1 の比率で混合した餌を投与しました。成虫は 5% グルコース溶液で維持しました。使用した試薬および装置は材料表に記載しています。
1. 材料の調製
<ol>
	<li>溶液の調製
	<ol>
		<li>1x PBS緩衝液の調製：NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 gを量り取る。撹拌しながら800 mLの超純水に溶解させる。pHを7.4に調整する。最終容量を1 Lにする。121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌する。</li>
		<li>DEPC溶液の調製：1 Lの超純水にDEPCストック溶液 1 mLを加える。マグネチックスターラーで12～16時間激しく撹拌する。121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌する。 
		注意： DEPCは毒性が非常に高く、発がん性がある。手袋と保護メガネを着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。 
		注： 激しく撹拌する際は、ビーカーをアルミホイルで覆う。DEPC溶液を分注し、-20 °Cで最大6ヶ月間保存する。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消耗品の準備
	<ol>
		<li>解剖器具の滅菌：1 mmの解剖用針と微小ピンセットをアルミ容器に入れ、121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌する。</li>
		<li>0.5～1.0 mmのシリカビーズを含む2 mL研磨チューブを準備する。アルミ容器に入れ、121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌する。</li>
		<li>各研磨チューブに、キット付属のRNA保存溶液を200 µL加える。 
		注： 組織内のRNA品質は、生体から摘出した後1分以内に著しく低下する。保存溶液を入れた研磨チューブを事前に準備しておくこと。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ae. albopictusの採集
注： 白衣と手袋を着用してください。暗い色の衣服は蚊を引き寄せるため、着用しないでください。
<ol>
	<li>Ae. albopictusの脱走を防ぐため、蚊のケージがある部屋のすべてのドア、窓、および換気システムを閉じます。</li>
	<li>電動アスピレーターの電源を入れ、蚊のケージ内に挿入します。アスピレーターをケージの内壁に静止しているAe. albopictusに向け、蚊を回収します。</li>
	<li>アスピレーターを作動させたまま、ゆっくりとケージから引き出します。直ちにケージを密閉し、アスピレーターの蓋を閉じます。</li>
	<li>回収チャンバーを取り出し、-20 °Cで2分間置いてAe. albopictusを低温麻酔させます。</li>
	<li>10 cmのガラス皿を氷上に置いて予冷します。回収チャンバーから低温麻酔させたAe. albopictusをガラス皿に移します。 
	注： 組織の損傷を防ぐため、低温麻酔の時間を厳密に管理してください。</li>
</ol>
3. 解剖前のメス Ae. albopictus の同定
<ol>
	<li>ガラスシャーレから、形態的に完全で、冷麻酔状態にあるAe. albopictusを選択し、ガラススライド上に移す。実体顕微鏡を用いて80倍の倍率で観察する。</li>
	<li>中胸背板にある白い縦条を確認する。</li>
	<li>跗節の基部および第II〜VI腹部背板の基部にある白い帯を確認する12。</li>
	<li>触角を80倍の倍率で観察する。糸状の触角（雌）と羽毛状の触角（雄）を区別し、雌を特定する。</li>
</ol>
4. Ae. albopictusの腹部解剖
<ol>
	<li>滅菌済みのガラススライド上に、滅菌済みの1x PBSを左から右へ3滴、各滴の量を約20 µLとし、約5 mmの間隔をあけて滴下する。 
	注： PBSの滴は、Ae. albopictus全体を浸すのに十分な大きさである必要がある。</li>
	<li>精密ピンセットを用いてAe. albopictusの翅をつかみ、最も左側のPBS滴の中に蚊を置く。</li>
	<li>Ae. albopictusの腹側を上に向けた状態で配置する。左手で解剖針を持ち、第2腹節を押し付けてAe. albopictusを固定する。</li>
	<li>右手で1 mmの解剖針を第6腹節の中央に刺入する。横方向に半円状の切開を加え、腹腔を開く。</li>
	<li>右手の解剖針を後方に約2 mm移動させ、第VI–VIII腹節の中央領域を押し付けて腹部を固定する。 
	注： 卵巣は第II-VI腹節内の背側に位置している。卵巣の完全な形態を損なわないよう、第VI-VIII腹節を押し付ける際に針を不必要に動かさないこと。</li>
	<li>左手で解剖針を用いて第2腹節をつかみ、ゆっくりと外側に引いて第6節で腹部を分離させる。分離させることで、前腸、中腸、およびマルピーギ管が完全に露出する。 
	注：マルピーギ管は白く細い。中腸は半透明で紡錘形である。</li>
	<li>中腸を前腸および後腸から分離する。中央のPBS滴の中で中腸を2回洗浄する。</li>
	<li>市販のRNA抽出キットに付属のRNA保存液200 µLを含む研磨管に中腸を移す。</li>
	<li>解剖針で第8腹節の中央を押し、両側の対になった卵巣を露出させる。卵巣を取り出して中央のPBS滴で2回洗浄し、200 µLのRNA保存液を含む研磨管に移す。 
	注： 対になった卵巣は対称的で、米粒状の乳白色をしている。回収時に卵巣の構造的完全性を維持するため、慎重に取り扱うこと。</li>
</ol>
5. Ae. albopictusの唾液腺の摘出
<ol>
	<li>顕微鏡の倍率を400倍に上げます。腹部を解剖したAe. albopictusを、最も右側のPBSドロップに移動させます。</li>
	<li>左手の解剖針を用いて、頭部がわずかに持ち上がるまで中胸に軽く圧力をかけます。</li>
	<li>右手で解剖針を用いて頸部から頭部を持ち上げ、ゆっくりと外側に引きます。唾液腺（三葉構造）が頭部と共に胸部から剥離する様子を確認します。 
	注： 唾液腺は前胸部に位置し、唾液管をvia頭部に接続しています。胸部に一定の圧力をかけることで、唾液管の破裂を防ぎ、唾液腺を頭部と共に損なわずに胸部から剥離させることができます。このステップにおける力の調節には、繰り返し練習が必要です。</li>
	<li>唾液腺を頭部から分離します。中央のPBSドロップで2回洗浄し、準備した研磨チューブに移します。 
	注： 唾液腺の大きさは約1 mmです。200 µLのRNA保存溶液が入った研磨チューブに移し、白色光源に照らして、溶液中に小さな白い点状のものが浮いていることを確認してください。</li>
</ol>
6. Ae. albopictusおよびその唾液腺、卵巣、中腸からのRNA抽出
注：すべてのRNA抽出工程は、市販の組織RNA抽出キットの製造者の指示に従い、変更を加えずに行われました。
<ol>
	<li>組織グラインダーを4 °Cに予冷する。パラメータを30 Hz、研磨時間30 s、10サイクル、休止時間8 sに設定する。</li>
	<li>組織サンプルが入った研磨チューブをグラインダーにセットし、プログラムを実行する。 
	注： 研磨後、組織がRNA保存溶液に完全に分散しているかを確認する。研磨が不十分な場合は、さらに5サイクル実行する。</li>
	<li>ホモジネートを滅菌済みの1.5 mL遠心チューブに移す。4 °C、12,000 x gで5分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を新しい滅菌済み1.5 mL遠心チューブに移す。クロロホルムを30 µL加える。 
	注意： クロロホルムは毒性および発がん性がある。手袋と保護メガネを着用し、ドラフト内で取り扱うこと。</li>
	<li>20秒間激しくボルテックスする。室温で15分間インキュベートした後、4 °C、12,000 x g で15分間遠心分離する。 
	注： タンパク質の混入を防ぐため、中間の白色層を避け、上層の水相を慎重に吸引する。</li>
	<li>上層の水相を新しい滅菌済み1.5 mL遠心チューブに移す。イソプロパノールを75 µL加える。</li>
	<li>転倒混和し、混合液全体をシリカスピンカラムに移す。12,000 x gで1分間遠心分離する。</li>
	<li>カラムに洗浄バッファーを600 µL加える。12,000 x gで30秒間遠心分離し、フロスルーを捨てる。</li>
	<li>カラムに80%エタノールを600 µL加える。12,000 x gで30秒間遠心分離し、フロスルーを捨てる。この洗浄ステップをもう一度繰り返し、計2回洗浄する。</li>
	<li>カラムメンブレンの中央にDEPC処理水 30 µLを加える。室温で1分間インキュベートする。</li>
	<li>カラムを滅菌済みの1.5 mL遠心チューブにセットする。12,000 x gで1分間遠心分離し、RNAを溶出させる。</li>
	<li>溶出したRNAを1 µL取り、マイクロボリューム分光光度計を用いて濃度と純度を測定する。</li>
</ol>
7. RNA逆転写
<ol>
	<li>反応系の調製
	<ol>
		<li>4x 逆転写マスターミックス、ヌクレアーゼフリー水、およびRNAテンプレートを氷上で融解する。</li>
		<li>200 µL PCRチューブに、4x 逆転写マスターミックス 5 µL、全RNAテンプレート 10 µL、およびヌクレアーゼフリー水 5 µLを加え、20 µLの反応系を調製する。</li>
		<li>1,000 x gで1分間短時間遠心し、反応混合物をチューブの底に集める。</li>
		<li>PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、以下の逆転写プログラムを実行する：50 °Cで5分間、85 °Cで5秒間。 
		注： RT-qPCRへの潜在的な阻害剤の影響を軽減するため、逆転写産物は使用前に20倍に希釈すること。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. リアルタイム定量PCR (RT-qPCR)
<ol>
	<li>RT-qPCR反応系の調製
	<ol>
		<li>2x SYBR Green qPCRマスターミックス、cDNAテンプレート、および10 µMのフォワードおよびリバースプライマーを、全工程を通じて遮光しながら氷上で解凍する。</li>
		<li>96ウェルPCRプレートを用い、1ウェルあたり10 µLの2x SYBR Green qPCRマスターミックス、10 µMのフォワードおよびリバースプライマーを各0.8 µL（最終濃度400 nM）、20倍希釈したcDNAテンプレート2 µL、およびヌクレアーゼフリー水6.4 µLを添加し、20 µLの反応系を調製する。</li>
		<li>96ウェルプレートを光学用接着フィルムでシールし、すべてのウェルが完全に密封されていることを確認する。</li>
		<li>1,000 x gで1分間遠心分離し、反応混合物をウェルの底に集める。</li>
		<li>PCRプレートをリアルタイムPCR検出システムにセットし、サーマルサイクリングプログラムを実行する。 
		注：サーマルサイクリングプログラム：予備変性 95 °Cで30 s（1サイクル）；増幅 95 °Cで30 s、60 °Cで30 s（40サイクル）；融解曲線分析 95 °Cで15 s、60 °Cで1 min、0.15 °C/sで95 °Cまで昇温。各組織RNAサンプルについて、4連のテクニカルリプリケートでqPCRを行う。各組織サンプルは、5匹のAe. albopictusからプールした組織で構成される。RT-qPCRに使用したプライマー配列は表1に記載している。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>データ解析
	<ol>
		<li>各プライマーペアの融解曲線を確認し、単一で明確な解離ピークがあることを確認する。</li>
		<li>装置ソフトウェアからCt値をエクスポートする。グラフ作成およびデータ解析は、統計・作図ソフトウェアを用いて行う。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >プライマー名</td>
			<td >プライマー配列 (5'-3')</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus β-actin フォワードプライマー&#160;</td>
			<td >GGAGAAGATCTGGCATCACA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus β-actin リバースプライマー</td>
			<td >TGTCATCTTCTCGCGGTTAG</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus GAPDH フォワードプライマー</td>
			<td >CTGCCAAGGCTGTCGGTAA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus GAPDH リバースプライマー</td>
			<td >TCATAGGAGGCAGGCTTGGA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus RPS6 フォワードプライマー</td>
			<td >ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ae. albopictus RPS6 リバースプライマー</td>
			<td >CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：～のプライマー配列 *Ae. albopictus* RT-qPCRで使用される.

<ol>
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</ol>

Ae. albopictusは、南極大陸を除くすべての大陸の温帯、亜熱帯、および熱帯地域に広く分布している13,14。デングウイルス（DENV）、ジカウイルス（ZIKV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）などのアルボウイルスの重要な媒介蚊として、中国の広東省において蚊媒介性疾患の集団発生を繰り返し引き起こしている15。
〜に関する研究を支援するため、 *Ae. albopictus*-関連ウイルスとその伝播を解明するため、我々は簡便な手法を開発した *Ae. albopictus* 組織。従来の解剖プロトコルにおいて、唾液腺の解剖中に頭部を胸部から分離させると、加えた力によって唾液腺が胸部または頭部のいずれかに付着したままになることがあります。唾液腺のサイズは約1mmと非常に小さいため、胸部内でそれらを特定することは困難になります。16本手法は、標準的な蚊の器官摘出プロトコルに基づいたものであり、前胸胸板および中胸胸板の下に位置する唾液腺の分離を最適化したものである。これらは400倍の倍率下で観察されるべきである。&#215; 倍率17解剖するには、1本の針で中胸を軽く押さえながら、もう1本の針で頭部を分離させる圧力を加え、唾液腺を損傷させずに脱落させます。この手法により、胸部内で唾液腺を探す手間が省け、腺への汚染や損傷を防ぐことができ、解剖全体の時間を短縮できます。卵巣は腹部第VI〜VIII節付近に位置しており、第6腹節から解剖を開始し、中腸、マルピーギ管、および卵巣を腹部から慎重に抽出することで保存されます。18この手法により、損傷のない唾液腺、癒着のない典型的な卵巣の形状、および断裂のない中腸が得られます（図2）。この解剖手法は、〜に関する研究において有用な指針となります。 *Ae. albopictus* および、媒介的に伝播するウイルスの複製、拡散、ならびに伝播。
Ae. albopictusの組織からのRNA抽出は、蚊媒介性ウイルスの検出において極めて重要である。従来のTRIzol法は時間がかかり技術的な習熟が必要であるが、一般的にRNA回収率が高く、正しく実施すれば高品質なRNAを得ることができる。対照的に、カラム法は再現性が高く操作が簡便であるが、RNA回収率が低くなる可能性があり、脂肪体への適用においては効率が低い19,20。本研究では、解剖した組織を速やかに核酸安定化剤で保存し、十分に摩砕した後、スピンカラム法を用いてcDNA合成用のRNAを抽出した21。cDNAの品質に変動がある中でRT-qPCRデータの正確な標準化を行うには、安定したリファレンス遺伝子が必要である22。Ae. albopictusのさまざまな発生段階におけるリファレンス遺伝子は確立されているが、組織特異的なリファレンス遺伝子についてはさらなる検証が必要である23,24。すべての解剖組織から逆転写されたRNAのRT-qPCR分析において、GAPDH、β-actin、およびRPS6の一貫した増幅が認められ、本解剖プロトコルで得られたRNA品質が、Ae. albopictusにおける後続の組織特異的遺伝子発現研究をサポートするに十分であることが確認された。
本プロトコルを用いてAe. albopictusの組織を解剖する際、唾液腺が頭部と一緒に外れないことが稀にあります。これは通常、胸部に十分な圧力がかかっていない状態で、頭部を急いで分離させたために起こります。これを解決するには、中胸に一定の圧力をかけながら頭部をゆっくりと外側に引き出し、唾液腺が頭部とともにそのまま外れるようにしてください。唾液腺をRNA保存溶液の入ったすり潰しチューブに移す際は、光源に照らして、溶液中に小さな白い点状のものが浮いていないか注意深く確認してください。チューブ内に唾液腺が見当たらない場合は、直ちに解剖針に付着したままになっていないかを確認してください。RNA抽出時は、キットメーカーのプロトコルに厳密に従ってください。得られたRNA濃度が低い場合は、溶出バッファーを用いて2回目の溶出を行うことができます。RT-qPCRにおいて、融解曲線に複数のピークが現れる場合がありますが、その場合はまずプライマーの特異性を確認してください。Ct値が高い場合は、プライマーの融解温度に従ってプログラムのアニーリング温度を調整してください。一般的に、プログラムのアニーリング温度は、プライマーの融解温度より1–2 °C低く設定する必要があります25。
本研究にはいくつかの限界がある。サンプル範囲が比較的狭く、中腸、唾液腺、および卵巣組織のみに焦点を当てており、マルピーギ管や脂肪体などの他の組織については調査していない26。さらに、分析は飼育下で育てられた3日齢の雌蚊に限定されており、吸血個体およびウイルス感染個体は除外された27。今後の改善策として、マルピーギ管などの組織までサンプル範囲を拡大し、異なる生理状態にあるAe. albopictus個体を検討することが挙げられる。
要約すると、Ae. albopictusから中腸、卵巣、および唾液腺を解剖し、続いて全RNA抽出を行うことで、その後の媒介能の評価およびアルボウイルス伝播研究のための技術的基盤が得られます。

Aedes albopictus (Ae. albopictus)は、デングウイルス (DENV) やチクングニアウイルス (CHIKV) を含む複数の病原体の媒介蚊である1,2,3。本種は広く分布しており、多くの地域で蚊媒介性疾患のアウトブレイクを引き起こしている4,5。ベクター能力として知られるAe. albopictusの病原体伝播能は個体群によって異なり、中腸、卵巣、および唾液腺における特定の遺伝子発現に関連している6。これらの組織の構造を理解し、高品質なRNAを抽出することは、ベクター媒介性ウイルスの複製、拡散、および伝播を解明する上で極めて重要である7。
定量リアルタイムPCR（RT-qPCR）による相対的な遺伝子発現の検出は、Ae. albopictus組織の精密な解剖と高品質なRNAの抽出に依存します8,9。これまで、中腸、卵巣、および唾液腺の解剖に関する公開ビデオプロトコルは、主にAedes aegyptiを対象としたものでした10。したがって、本プロトコルでは、Ae. albopictusから中腸、卵巣、および唾液腺を解剖する方法を実演します。この手法では、解剖した組織をRNA保存液の入った研磨チューブに直接入れることで、組織の転送ステップを省き、転送時の損失を最小限に抑えます。全RNAはカラム法を用いて解剖組織から抽出しますが、この方法は従来のTRIzol法よりも操作ステップが少なく、時間も短縮されます11。この抽出により、通常、5匹のAe. albopictusの唾液腺から0.1–0.3 µgの全RNAが得られ、A260/A280比は1.8–2.0となり、下流のRT-qPCRに必要な純度要件を満たします。RT-qPCRを行い、Ae. albopictusの各組織における3つのリファレンス遺伝子の発現量を測定することで、各組織から抽出されたRNAの品質を評価します。
なお、本プロトコルは、吸血していない3日齢の雌Ae. albopictusの中腸、卵巣、および唾液腺に対してのみ検証されており、脂肪体からのRNA抽出には適していないことに留意してください。完全で個別の組織を取得することが、その後の解析の基礎となります。Ae. albopictus組織の系統的な解剖と高品質なRNA抽出を通じて、本プロトコルは、その後の遺伝子発現検出、個体群レベルでの媒介能評価、およびアルボウイルスの伝播制御のための技術的支援を提供します。

<table><tbody><tr><td>3 mL 超ロングパストゥールピペット</td><td>全血（Whole Blood）</td><td>WHB-S4</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q711-02</td><td>500反応分</td></tr><tr><td>HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR キット</td><td>Vazyme</td><td>R433-01</td><td>100 反応分</td></tr><tr><td>マイクロ全RNA抽出キット</td><td>医療技術</td><td>MDT-CFR07</td><td>100T/箱</td></tr><tr><td>マイクロピペット 0.5-10&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4043444</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラス</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td>75 mm&amp;times;25 mm</td></tr><tr><td>マイクロ分光光度計</td><td>KAIAO</td><td>K5600C</td><td></td></tr><tr><td>核酸抽出バッファー</td><td>メドテック</td><td>MDT-TP01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>PBS リン酸緩衝生理食塩水（滅菌済み）</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>PCRサーマルサイクラー</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler X50s</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio™ 7 Pro リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td>EN61326-1</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 LAB顕微鏡セット</td><td>ZEISS</td><td>435063-9010-000</td><td></td></tr></tbody></table>

aedes albopictusの解剖および解剖後組織からの全rna抽出

Dissection of Aedes albopictus and Total RNA Extraction from Post-Dissection Tissues

2025年7月、中国広東省仏山市においてデング熱およびチクングニア熱のアウトブレイクが発生しました。Ae. albopictusは、これらのウイルスの主要な媒介蚊です。本プロトコルでは、Ae. albopictusの中腸、唾液腺、および卵巣を解剖し、解剖した組織から全RNAを抽出するための簡便で標準化された方法について説明します。吸血していない3日目の雌蚊を−20 °Cで2分間凍結させて麻酔をかけ、その後、標的組織を解剖しました。全RNAは組織RNA抽出キットを用いて抽出し、マイクロボリューム分光光度計で定量した後、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）解析に使用しました。その結果、この解剖法によって組織を迅速かつ完全に分離でき、分離した組織から得られたRNAは比較的高い純度に達することが示されました。RT-qPCRにより、3つのリファレンス遺伝子（GAPDH、β-actin、およびRPS6）の発現パターンと相対的な安定性が実証されました。本手法は簡明かつ検証されており、Ae. albopictusに関連する研究に標準的な技術的支援を提供します。

本研究は、Ae. albopictusの解剖と、解剖後の組織からのRNA抽出の2つのパートで構成されています。全体のワークフローは図1に示されており、図1AはAe. albopictusの解剖を、図1BはRNA抽出およびその後のリファレンス遺伝子の発現レベルの検出について説明しています。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72811/72811fig1.jpg" /> 
図1: Ae. albopictusの解剖および解剖後組織からの全RNA抽出の概略図。 (A) Ae. albopictusの採集、麻酔、および解剖。 (B) 解剖後組織からのRNA抽出、純度の確認、およびリファレンス遺伝子の発現レベルの検出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72811/72811fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
研究室で飼育された5匹の *Ae. albopictus* 中腸、唾液腺、および卵巣を単離するために解剖を行った。倍率80倍で&#215;、透明な前腸、中腸、および後腸を持つ *Ae. albopictus* はっきりと観察でき、粒状の卵巣が両側に位置し、白いマルピーギ管に覆われていた（図2A）。視野を400倍に調整したとき&#215;、～の半透明の唾液腺 *Ae. albopictus* 明確に観察可能となった（図2B). 図&#160;2C,D 図説する&#160;分離した中腸および卵巣組織。結果は、この解剖法で分離した組織が構造的完全性を保持していることを示しており、これは解剖後の検体から全RNAを抽出する後続の工程において不可欠である。
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72811/72811fig2.jpg" /> 
図2: Ae. albopictus組織の解剖後解析. (A) Ae. albopictusの腹部から組織を分離する。 (B) Ae. albopictusの半透明で三葉状の唾液腺。 (C) Ae. albopictusの前腸および中腸。 (D) Ae. albopictusの米粒状の対になった卵巣。 I: 前腸、II: 中腸、III: 後腸、IV: マルピーギ管、V: 卵巣。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72811/72811fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
Ae. albopictusの解剖組織から全RNAを抽出した。抽出前に組織サンプル（唾液腺、中腸、および卵巣）を完全に摩砕した。RNA濃度は組織型によって異なり、唾液腺は7.8 ng/µLであったのに対し、メスのAe. albopictusの中腸、卵巣、および全身ホモジネートはそれぞれ55.3、45.7、および42.7 ng/µLであった。すべてのサンプルは高い純度を示し、A260/A280比は1.87–2.10、A260/A230比は1.73–2.13であった（表2）。3つの候補リファレンス遺伝子（GAPDH、β-actin、およびRPS6）の発現レベルを、すべての組織においてRT-qPCRで評価した。これらの発現はRNA濃度によって多少変動したが、3つの遺伝子すべてが異なる組織型間で比較的安定していた（図3）。GAPDH、β-actin、およびRPS6は、Ae. albopictusの異なる組織における遺伝子発現を正規化するための安定したリファレンス遺伝子として適している。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >組織</td>
			<td >サンプル数</td>
			<td >RNA濃度 (ng/μL)</td>
			<td >A260/A280</td>
			<td >A260/A230</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >唾液腺</td>
			<td >5</td>
			<td >7.8</td>
			<td >1.87</td>
			<td >1.73</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >中腸</td>
			<td >5</td>
			<td >55.3</td>
			<td >1.94</td>
			<td >1.98</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >卵巣</td>
			<td >5</td>
			<td >45.7</td>
			<td >2.10</td>
			<td >2.13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >雌</td>
			<td >1</td>
			<td >42.7</td>
			<td >2.04</td>
			<td >1.92</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：〜から抽出したRNAの濃度および純度 *Ae. albopictus* 組織.
<img alt="図 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72811/72811fig3.jpg" /> 
図 3: RT-qPCRにより検出されたリファレンス遺伝子（GAPDH、β-actin、およびRPS6）のCt値. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72811/72811fig3large.jpg" target="_blank">こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。</a>

ここでは、蚊媒介性ウイルス伝播研究におけるベクター組織の分子生物学的特性解析のため、Aedes albopictusから中腸、卵巣、および唾液腺を摘出する方法と、それに続く全RNA抽出のプロトコルを提示します。

Aedes albopictusの解剖および解剖後組織からの全RNA抽出

2025年7月、中国広東省仏山市において、デング熱およびチクングニア熱のアウトブレイクが発生した。Ae. albopictusは、これらの...

このプロトコルでは、*Aedes albopictus*から主要動脈および唾液腺を解剖学的に摘出し、続いて摘出組織から全RNAを抽出する方法について説明します。蚊媒介性ウイルスに対する*Aedes albopictus*の媒介能は、これらの組織における遺伝子発現パターンと密接に関連しています。したがって、組織特異的な遺伝子発現プロファイルを正確に特性解析するためには、解剖学的構造の明確な理解と高品質なRNA抽出を組み合わせることが不可欠です。羽化して3日経った雌の蚊を選択します。－20 °Cで2分間冷凍し、麻酔を誘導します。滅菌済みのガラススライド上に、滅菌済み1x PBSを左から右へ3滴、各滴の容量は約20 µL、間隔は約5 mmになるように滴下します。精密ピンセットでAedes albopictusの翅を掴み、最も左側のPBSの滴の中に蚊を配置します。Aedes albopictusの体長は約2から10 mmで、体色は濃い黒色です。中胸背板には白い縦条があり、脚の跗節の基部には白い帯状の模様が見られ、また、第2から第6腹節の背板の基部にも白い帯状の模様があります。Aedes albopictusの腹側を上に向け、左手で解剖針を持ち、第2腹節を押し当ててAedes albopictusを固定します。右手で1 mmの解剖針を第6腹節の中点に刺入し、切開して腹腔を開きます。腹部を固定するため、第6腹節から第8腹節の中間領域を通過させます。左手で解剖針を用いて第2腹節を掴み、外側へゆっくりと引いて第6節で腹部を分離します。分離すると、前腸、中腸、およびマルピーギ管が完全に露出するため、中腸を前腸および後腸から分離します。中腸を中心部のPBS液滴で2回洗浄し、すり潰しチューブに移します。解剖針で第8腹節の中央を押し、両側の対になった卵巣を露出させます。卵巣を取り出して洗浄し、すり潰しチューブに移します。顕微鏡の倍率を400倍に上げます。左手の解剖針で中胸に軽く圧力をかけ、頭部がわずかに持ち上がるまで押し下げます。右手で解剖針を用いて頸部を持ち上げ、ゆっくりと外側へ押し出します。唾液腺が頭部とともに胸部から分離する様子を確認します。これらを洗浄し、用意しておいたホモジナイザーチューブ（研磨管）に移します。組織ホモジナイザーをあらかじめ冷却し、パラメータを設定します。組織ホモジナイザーで組織を研磨します。組織ホモジネートを遠心管に移し、低温・高速で遠心分離を行います。上清を回収し、クロロホルムを加えてボルテックスし、室温でインキュベートした後、再度遠心分離します。水相を新しい滅菌遠心管に移し、イソプロパノールを加えて十分に混合した後、吸着カラムに移して遠心分離します。洗浄バッファーで洗浄し、次いで80%エタノール溶液で2回洗浄します。カラム膜にDEPC処理水を加え、室

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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Aedes albopictusの解剖および解剖後組織からの全RNA抽出

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