Name: 3D細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた機械的圧縮下でのNK細胞による乳がんスフェロイド（MCF-7）の細胞傷害活性評価法。リアルタイムイメージングで免疫細胞の抗腫瘍機能を解析し、がん免疫療法の新たな治療戦略開発に貢献します。

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本研究は、米国国立がん研究所の助成金（助成金番号 R01CA221346）、コーネル大学工学部からFMに授与されたLance R. Collins Fellowship、およびコーネル大学プロボスト研究レジリエンス基金からFMへの助成により支援されています。本研究の一部は、米国国立科学財団（助成金番号 NNCI-2025233）の支援を受ける国立ナノテクノロジー調整インフラ（NNCI）の加盟機関であるCornell NanoScale Facilityにて実施されました。

1. デバイス構成部品の準備
<ol>
	<li>サンプルロードチャンバーの表面活性化
	<ol>
		<li>ウェルのみが露出するように、サンプルロードチャンバー（レイヤー1、L1）にマスクを配置します。</li>
		<li>高出力設定（45 W）を用い、マスクされた第1層を15秒間酸素プラズマに曝露する。</li>
		<li>レイヤー1をシャーレに入れ、その後、バイオセーフティキャビネット内で以下の手順を続行します。</li>
		<li>各ウェルを〜で処理する 10 &#181;L 1%ポリエチレンイミン（PEI）で10分間処理する。</li>
		<li>ガラス表面を傷つけないよう、各ウェルの四隅から真空吸引を行い、ウェル内のPEIを除去します。</li>
		<li>ウェルを～で洗浄する 10 &#181;L リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、その後、側方から真空吸引によって洗浄液を除去します。</li>
		<li>ウェルに～を添加して処理する 10 &#181;L 0.1%グルタラアルデヒドで30分間処理した後、隅から真空吸引によりグルタラアルデヒドを除去する。</li>
		<li>ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄後に隅に残った洗浄液を除去する。</li>
		<li>第1層を含むペトリ皿をホイルで包み、バイオセーフティキャビネット内で一晩静置する。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滅菌 金属フレームの
	<ol>
		<li>38 mmのものを浸します。 &#215; 88 mmのメタルフレームと12本のM2.5パンヘッドネジを、70%エタノールに一晩浸漬します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>プライミング 圧力制御ユニットの
	<ol>
		<li>高出力設定（45 W）を用い、圧力制御ユニットを30秒間酸素プラズマに曝露させる。</li>
		<li>圧力制御ユニットの機能面を下に向けて脱イオン（DI）水に一晩浸し、ユニット内のチャネルとチャンバーを満たします。</li>
		<li>翌日、浸漬させていた脱イオン（DI）水から圧力制御ユニットを取り出します。</li>
		<li>マイクロ流体リザーバーに超純水（DI water）を50 mL充填します。 
		注： マイクロフルイディクス用リザーバーは、2本のチューブ接続部（空気圧ライン用チューブと液体供給ライン用チューブ）を備えたカスタム蓋を取り付けた50 mLコニカルチューブで構成されています。</li>
		<li>空気で満たしたシリンジを空気圧チューブラインに接続します。</li>
		<li>シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げてリザーバーを加圧し、チューブ内が満たされ、チューブの端から水が滴り始めるまで、脱イオン水（DI water）を流体輸送チューブに流します。</li>
		<li>あらかじめ充填され、液体が滴下している流体供給チューブをポリカーボネート製のマニホールドに接続し、次に圧力制御ユニット背面にある1.5 mmのインレットに接続します。</li>
		<li>圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリを2時間、風乾させます。完全に乾燥したら、圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリは次のステップに進む準備が完了したことになります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. デバイスの組み立て
<ol>
	<li>細胞埋込コラーゲンの調製
	<ol>
		<li>70%エタノールから金属フレームとネジを取り出し、乾燥させる。</li>
		<li>バイオセーフティキャビネット内に、3つの 600 &#181;L 氷上のマイクロチューブ。チューブに次のようにラベルを貼る。 &#34;N&#34; （中和）、 &#34;sp&#34; （MCF-7スフェロイド）、および &#34;sp+NK&#34; （NK細胞を含むMCF-7スフェロイド）</li>
		<li>10を加えて中和混合液を調製します。&#215; 必要量のMedium 199 (M199)および水酸化ナトリウム (NaOH)を &#34;N&#34; チューブ</li>
		<li>M199:NaOH混合液の適切な量を、〜に分注します。 &#34;種&#34; および &#34;sp+NK&#34; 最終濃度を1にするためのチューブ&#215; 濃度</li>
		<li>腫瘍スフェロイドを回収し、141 [g]（またはrpm）で遠心分離する。 &#215; g スフェロイドをチューブの底に沈降させるため、3分間静置します。 
		注：腫瘍スフェロイドは約 200 &#181;m 直径（の）～は、既報のアガロースマイクロウェルプラットフォームを用いて作製された。16簡潔に述べると、3 &#215; 106 MCF-7細胞を36ウェルプレートに播種した。 &#215; ウェルで構成される36個のアガロースマイクロウェルアレイ 200 &#181;m 直径で、および 200 &#181;m 深く植え込み、その後7日間培養して、実験に使用する腫瘍スフェロイドを作製した。</li>
		<li>上清を注意深く除き、スフェロイドを以下の溶液で再懸濁します。 200 &#181;L 50:50のMCF-7/NK完全培地（表1 および 表2).</li>
		<li>NK細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、141（※数値が未完）で遠心分離する。 &#215; g 4分間放置し、細胞数を計測する。 
		注意：NK細胞の生存率は～である必要があります。 &#62;実験当日に85%とする。</li>
		<li>得られたペレットを〜に再懸濁します。 200 &#181;L 完全NK培地の。</li>
		<li>各マイクロ遠心チューブに、適切な容量のコラーゲンストック溶液を加えます。</li>
		<li>最終容量がとなるように、各チューブに適切な量の細胞懸濁液を加えます。 200 &#181;L 1.5 mg/mLのコラーゲンを含有する。 
		注： &#34;種&#34; 懸濁液には腫瘍スフェロイドのみが含まれているが、一方で &#34;sp+NK&#34; 懸濁液には腫瘍スフェロイドと1.5が含まれている &#215; 106 NK細胞</li>
		<li>気泡の発生を最小限に抑えつつ、細胞とコラーゲンが均一に分散するように、ピペッティングにより穏やかに混合します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>デバイスの組み立てと細胞の播種
	<ol>
		<li>乾燥させた金属フレームの中にレイヤー1を配置します。</li>
		<li>負荷 9&#160;&#181;L コラーゲン混合液を各ウェルに分注します。</li>
		<li>顕微鏡を用いて、圧力制御ユニットおよびマニホールドアセンブリをレイヤー1上のセルチャンバーに合わせて調整してください。</li>
		<li>乾燥させたネジをマニホールドに通して金属フレームに挿入し、マニホールドと金属フレームの間で圧力制御ユニットとレイヤー1を固定します。</li>
		<li>組み立てた装置を、 37 &#176;C, 5% CO2&#8322; コラーゲンの重合を促進するため、インキュベーターで45分間静置する。</li>
		<li>4つの培地ポートから、MCF-7/NK完全細胞培養培地を50:50の割合で加えます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腫瘍と免疫細胞の相互作用のイメージング
<ol>
	<li>組み立てたデバイスを、ライブセルイメージング用に倒立エピ蛍光顕微鏡に搭載したステージインキュベーター内に設置する。 
	注：ステージインキュベーターは、イメージング期間中、温度37 °C、湿度約50%に維持した。</li>
	<li>イメージング期間中、内部環境を37 °C、湿度100%、5% CO₂に維持するため、組み立てたデバイスの上に二次ハウジングボックスを被せる。</li>
	<li >空気圧チューブを使用して、デバイスを圧力コントローラーに接続する。</li>
	<li>圧縮後のスフェロイドの変形を評価できるように、圧縮を加える前に腫瘍スフェロイドの明視野像およびGFP像を取得する。</li>
	<li>イメージング期間中、120 mbarの一定圧を加える。 
	注：圧力コントローラーのソフトウェアにより、実験中に適用する圧力プロファイルと大きさを定義できる。Supplementary Figure 1に圧力制御システムの概略図を示す。</li>
	<li>10 minごとに18 hの間、明視野像およびGFP像を取得し、タイムラプスイメージングを開始する。 
	注：画像は、倒立エピ蛍光顕微鏡の20×対物レンズを用いて、各腫瘍スフェロイドの中心Z平面で取得した。明視野像とGFP蛍光像の露光時間は、それぞれ200.1 msおよび298.9 msとした。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.</li>
	<li>Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.</li>
	<li>Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.</li>
	<li>Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.</li>
	<li>Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.</li>
	<li>Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.</li>
	<li>Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.</li>
	<li>Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.</li>
	<li>Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.</li>
	<li>Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.</li>
	<li>Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.</li>
	<li>Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.</li>
	<li>Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.</li>
	<li>Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.</li>
	<li>Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.</li>
	<li>Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.</li>
	<li>Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.</li>
	<li>Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

本手法では、微小流体圧縮デバイスを用いて、圧縮ストレスが腫瘍と免疫細胞の相互作用に及ぼす影響を調査する方法について記述します。このシステムは、3Dコラーゲンマトリックス内に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに対し、制御された機械的圧縮を加えることが可能です。細胞チャンバー（L1）の底部を形成するガラス基板により、高解像度の生細胞イメージングが可能となり、免疫細胞の運動性、浸潤、および細胞毒性活性の定量化を目的とした研究に適したプラットフォームとなっています。重要な点として、本システムは細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用を維持しつつ、機械的環境を精密に制御することを可能にします。対照的に、圧縮ストレスを研究するための既存の多くの実験的手法では、ECM介在性の細胞相互作用9,13と高解像度イメージング14との間でトレードオフが生じます。
本研究では、NK細胞とMCF-7乳がん腫瘍スフェロイドをモデルシステムとして使用しま...

細胞ベースのがん免疫療法は、免疫細胞を利用してがん細胞を標的とする治療アプローチである1。この戦略は、血液がんの治療において顕著な成功を収めている2,3,4。しかし、血液がんで見られた成功レベルは、固形がんの治療にはまだ十分に転用されていない5,6,7。この制限の大きな理由の一つに、固形がんに特有の免疫抑制的な腫瘍微小環境（TME）がある。
腫瘍微小環境（TME）は、細胞の挙動を制御し得る特有の機械的な手がかりによって特徴づけられます。免疫細胞が腫瘍細胞を効果的に殺傷するには、標的細胞に力を及ぼし、細胞傷害性分子を放出するための免疫シナプスを形成する必要があります8。したがって、機械的な力が免疫細胞の機能にどのように影響するかを理解することは、固形腫瘍に対する細胞ベースの免疫療法の有効性を向上させるための、新たな治療戦略を見出すことにつながる可能性があります。
固形腫瘍の腫瘍微小環境（TME）における決定的な機械的特徴は、成長する腫瘍に対してTMEが及ぼす圧縮ストレスである9,10。これまで、圧縮に関する研究の多くは、腫瘍細胞の挙動への影響に焦点を当ててきた10,11。圧縮がTME内の免疫細胞にどのように影響するかという理解へと関心が移ったのは、ごく最近のことである12。その結果、圧縮ストレスがナチュラルキラー（NK）細胞の遊走、免疫シナプスの形成、および細胞傷害活性に影響を及ぼすメカニズムは、依然として十分に解明されておらず、定量化も不十分である。この空白は、TME内の機械的手がかりをどのように利用して固形腫瘍への免疫標的化を強化できるかという理解において、重大な制限となっている。
この問題を解決する上での大きな障壁となっているのは、生理学的に適切な3D微小環境内で制御可能かつ定量的な圧縮を加えながら、同時に腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームが不足していることです。圧縮ストレスを研究するための初期の実験的アプローチでは、スフェロイドをアガロースゲルに埋め込む方法が用いられていました13。この方法は物理的な拘束を効果的に再現できましたが、天然の細胞外マトリックス（ECM）と細胞の相互作用が排除されていました。Dolegaらは、浸透圧をかけて圧縮ストレスを誘導しましたが、スフェロイドは培養液中に懸濁されていたため、ECMとの相互作用がないままでした9。Pandeyらは、トランスウェルインサートと重りを用いてコラーゲンに埋め込まれたスフェロイドを圧縮させ、これによりECMと細胞の相互作用は維持されましたが、免疫細胞の運動能や細胞毒性活性を定量化するために必要な高解像度イメージングが制限されました14。これらの限界により、腫瘍微小環境（TME）内での圧縮に対する細胞の形態的応答をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームの必要性が浮き彫りになっています。
本稿では、生理学的に重要なECM-細胞間相互作用を維持しつつ、圧縮ストレスの制御された印加を可能にし、免疫-腫瘍ダイナミクスの高解像度ライブセルイメージングをサポートする、マイクロ流体圧縮デバイス15のプロトコルを提示します。本プロトコルは、デバイス構成要素の準備（セクション1）、デバイスの組み立て（セクション2）、および腫瘍-免疫相互作用のイメージング（セクション3）で構成されています。ここでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）標識腫瘍スフェロイドに対するNK細胞殺傷アッセイを用いて、ワークフローを実証します。本プラットフォームは、このアプリケーション以外にも、3D微小環境における幅広い細胞型および細胞間相互作用に対する機械的な力の影響を調査するために容易に適応させることが可能です。

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79724</td><td>7 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>10&amp;times; M199培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ThermoFisher</td><td>313500100</td><td></td></tr><tr><td>エアコンプレッサー</td><td>Elveflow</td><td>Jun-Air モデル3 コンプレッサー</td><td></td></tr><tr><td>自動X-Y顕微鏡ステージ</td><td>応用科学計測機器</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GeminiBio</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>流体輸送チューブ</td><td>Eleveflow</td><td>PTFEチューブ予備ロール</td><td>外径 1/16 インチ</td></tr><tr><td>蛍光光源</td><td>Excelitas Technologies&amp;nbsp;</td><td>X-Cite シリーズ 120 PCユニット</td><td></td></tr><tr><td>葉酸</td><td>シグマ</td><td>F7876</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>電顕科学&amp;nbsp;</td><td>16019</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Harrick プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td>高出力設定（45W）</td></tr><tr><td>ウマ血清 (HS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>20倍対物レンズ（NA = 0.25）、Olympus CellSensソフトウェアを用いて操作</td></tr><tr><td>マスク</td><td>Artus</td><td>10枚セット アルミニウム製シムストック</td><td>厚さは0.0125である&quot; (0.75 mm)</td></tr><tr><td>MCF-7/GFP (ピューロマイシン) 安定発現細胞株</td><td>GenTarget Inc</td><td>SC050-G</td><td></td></tr><tr><td>金属製フレーム</td><td>カスタムメイド&amp;nbsp;</td><td>特注品&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体リザーバー</td><td>Eleveflow</td><td>50 mLマイクロ流体リザーバー&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>4倍対物レンズ&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (NA = 0.1)</td></tr><tr><td>ミオイノシトール</td><td>シグマ</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 MI</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>空気圧チューブ</td><td>エレブフロー</td><td>PURポリエーテル透明パイプ投入口</td><td>4&quot; 外径 mm</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>1%</td></tr><tr><td>圧力コントローラ</td><td>Elveflow</td><td>OB1 NK4</td><td>Elveflow Smart Interfaceソフトウェアを使用して操作</td></tr><tr><td>ラット尾由来I型コラーゲン&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>31.3 &amp;micro;L 9.6 mg/mLのコラーゲンストック溶液から</td></tr><tr><td>ネジ</td><td>フィリップス</td><td>M2.5 パンヘッド</td><td>ネジ12本</td></tr><tr><td>ステージインキュベーター</td><td>高精度プラスチック</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Becton Dickinson</td><td>303134</td><td>3/32インチへのオスルアーインテグラルロックとのペアリング&quot; Eleveflow製ODバーブ</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM培地</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr></tbody></table>

3d細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

A Microfluidic Platform for Studying Roles of Mechanical Compression in Tumor-Immune Cell Interactions in a 3D Extracellular Matrix

細胞ベースの免疫療法において、機械的な力は免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷能力に大きな影響を及ぼします。腫瘍細胞を殺傷するためには、免疫細胞が標的細胞に力を加え、免疫シナプスを形成して、granzyme Bを含む細胞毒性分子を放出させる必要があります。その重要性にもかかわらず、免疫介在性の殺傷能力を高めるために機械的な刺激をどのように活用できるかは、まだ十分に解明されていません。この知見の不足は、生理学的に現実的な環境において、細胞培養に適切に制御された機械的ストレスを負荷できるツールの欠如が一因となっています。本稿では、細胞外マトリックス（ECM）に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに静的または動的な圧縮を加えつつ、光学顕微鏡を用いて腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできるマイクロ流体圧縮デバイスについて説明します。
このマイクロ流体プラットフォームは、12個のコンパートメント（コントロール群6個、機能群6個）で構成されています。各コンパートメントには、圧力制御ユニットの直下に配置されたセルチャンバーが含まれています。ECMに埋め込まれたスフェロイドがこのセルチャンバー内に配置されます。本プラットフォームを用いて、規定の機械的圧縮下における、乳がん腫瘍スフェロイド（MCF-7）に対するナチュラルキラー（NK）細胞の殺傷効率を調査しました。その結果、1.5 mg/mLのコラーゲン中では、機械的圧縮の有無にかかわらず、NK細胞が腫瘍スフェロイド死の主要な要因であり続けることが示されました。&#160;したがって、NK細胞は圧縮ストレス下においても抗腫瘍活性を維持できることが示唆されます。これらの知見は、腫瘍と免疫細胞の相互作用における機械的な力の役割を調査する上での、本プラットフォームの有用性を実証するものです。現在、免疫細胞が圧縮ストレスに適応することを可能にする分子メカニズムの特定に向けた研究が進められています。これらの研究から得られる知見は、有望な治療法の提示につながる可能性があります。

以下の実験では、生理学的に適切な3D微小環境における腫瘍と免疫細胞の相互作用をモデル化し、同時に腫瘍スフェロイドに静的および動的な圧縮を加えることができるマイクロ流体圧縮デバイス15を使用しました（図1）。デバイスの構成要素（図1A1）およびその組み立て順序（図1A2）を図1Aに示します。金属フレームをデバイスのベースとし、そのフレーム内に細胞チャンバー層（L1）を配置します。L2とL3をプラズマ接合した圧力制御ユニットをL1の上に配置し、続いてマニホールドを重ねます（図1A2）。L1と圧力制御ユニットを合わせて機能的なマイクロ流体デバイスを構成し、これらを金属フレームとマニホールドの間に挟んで...

三次元（3D）環境における腫瘍と免疫系の相互作用をモデル化するための、マイクロ流体プラットフォームを用いたプロトコルを提示します。我々の結果から、ナチュラルキラー（NK）細胞は機械的な圧縮下においても抗腫瘍活性を維持することが明らかになりました。

3D細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

細胞ベースの免疫療法において、機械的な力は免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷能力に大きな影響を与えます。腫瘍細胞を殺傷するためには、...

本研究の目的は、機械的信号を用いて、免疫細胞が腫瘍細胞を効果的に殺傷する能力を向上させることです。このプロトコルは、多様な免疫細胞種および標的細胞モデルにおいて、圧縮ストレスを介した免疫細胞の殺傷能の調節を調査するために適用できます。まず、ウェルのみが露出するように、サンプルロードチャンバーにマスクを掛けます。マスクをしたLayer 1を、ハイパワー設定で15秒間酸素プラズマに曝露させます。次に、Layer 1をペトリ皿に入れます。各ウェルに1%ポリエチレンイミンを10 µL添加します。10分後、ガラス表面への傷を防ぐため、各ウェルの四隅から真空吸引してポリエチレンイミンを除去します。ウェルを10 µLのPBSで洗浄し、側面から真空吸引して洗浄液を除去します。その後、0.1%グルタルアルデヒドを10 µL添加し、30分間処理します。真空吸引を用いて、四隅からグルタルアルデヒドを除去します。次に、ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄後に四隅から洗浄液を除去します。その後、Layer 1の入ったペトリ皿をアルミホイルで包み、バイオセーフティキャビネット内で一晩静置します。滅菌のため、38 × 88 mmのメタルフレームと12本のM2.5ナベ頭ネジを70%エタノールに浸し、室温で一晩放置します。高出力設定を用い、圧力制御ユニットに30秒間酸素プラズマ処理を行います。圧力制御ユニットの機能面を下に向けて脱イオン水に浸し、チャネルとチャンバーを満たした状態で一晩放置します。マイクロ流体リザーバーに50 millilitersの脱イオン水を満たします。空気を充填したシリンジをニューマチックチューブラインに接続します。シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げてリザーバーを加圧し、チューブが満たされ、チューブから水が滴り始めるまで脱イオン水を流体輸送チューブ経由で流します。シリンジを切り離して圧力を解放した後、あらかじめ満たされ滴下している流体輸送チューブを、ポリカーボネートマニホールドを介して圧力制御ユニット背面の1.5-millimeter入口に接続します。圧力制御ユニットとマニホールドの組み立て体を2時間自然乾燥させます。金属フレームとドライバーを70%エタノールから取り出し、バイオセーフティキャビネット内で乾燥させる。容量600 µLのマイクロチューブ3本を氷上に置き、それぞれN、sp、sp+NKとラベルを付ける。Nチューブに必要量の10倍のMedium 199と水酸化ナトリウムを加え、中和混合液を調製する。Medium 199と水酸化ナトリウムの混合液をspおよびsp+NKチューブに適切な量分注し、最終濃度を1xにする。次に、MCF-7腫瘍スフェロイドを回収し、141 gで3分間遠心分離してチューブの底に沈降させる。上清を慎重に取り除き、等モル量のMCF-7およびナ

a-microfluidic-platform-for-studying-roles-mechanical-compression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介...

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。...

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

粒子追跡マイクロレオロジーは、3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の変化を非破壊的に定量化し、空間的にマッピングするために使用できます。...

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。...

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

ここでは、血液脳関門転移性腫瘍微小環境を調製し培養し、共焦点イメージングと人工知能(機械学習)を用いてその状態を定量化するためのプロトコルを提示する。...

臓器オンAチップ3Dモデル、機械学習、共焦点断層法による脳転移性腫瘍微小環境の定量化

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin...

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。...

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

学ぶマイクロ流体デバイスを用いた機械的圧縮下でのNK細胞による乳がんスフェロイド（MCF-7）の細胞傷害活性評価法。リアルタイムイメージングで免疫細胞の抗腫瘍機能を解析し、がん免疫療法の新たな治療戦略開発に貢献します。

3D細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

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