in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

In vivoでは、奇形腫形成は、細胞の多能性または3つの胚葉すべてを形成する能力を決定するためのゴールドスタンダードです。奇形腫も幹細胞移植の大きな障害であり、現在、成長動態における奇形腫の形成についてはほとんどわかっていません。未分化細胞が宿主環境に移植されると、生物発光レポーター、遺伝子形質導入、超高感度電荷結合デバイス(CCD)法の開発により、細胞位置の移動、増殖、分化をin vivoで非侵襲的に反復評価することが可能になりました。

このビデオでは、生きたマウスで移植されたヒト胚性幹細胞の増殖を効果的に追跡するための詳細なプロトコルを示します。こんにちは、スタンフォード大学医学部・放射線科のジョセフ・ウー研究室のキット・ウィルソンです。本日は、in vitroおよび生きたマウスへの移植後の両方で、ヒト胚性幹細胞をイメージングする手順をご紹介します。

これらの手順には、ヒト胚性幹細胞のin vitro生物発光イメージング、in vivoイメージングのためのマウス調製および幹細胞注射、および移植細胞のin vivo生物発光イメージングの次のステップが含まれます。それでは、これらの手順の主要なコンポーネントのいくつかを確認することから始めましょう。ヒト胚性幹細胞の生物発光イメージングを行うには、まず、ユビキチンやEEF One α培養物のような構成的プロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼなどのELルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現する細胞を得る必要があります。これは、フィーダーフリーの条件でELルシフェラーゼ陽性のヒト胚性幹細胞です。

通常、標準的なY細胞プロトコルに従い、コンディション培地または市販のフィーダーフリー培地のいずれかを使用して、マトリゲルでコーティングされた6枚のウェルプレートを使用します。ルシフェラーゼ陽性細胞を検出するには、レポーターにプローブdルシファーを用意する必要があります。1〜1.5ミリリットルの製剤でルシファーを1〜1.5ミリリットルの最終濃度で分注します。

使用しないときはアリコートを摂氏マイナス20度に保ち、保管しないときはペーパータオルで覆って光にさらされないようにしてください。ルシフェラーゼ陽性細胞を視覚化するために、2つの異なるイメージングシステムを使用します。in vitroの処置では、無菌イメージングシステムであるXeno IVUS 50を使用し、in vivoでは、Stanford Center for in vivo imagingに向かい、Xeno IVUS 200を使用します。

このシステムには、小動物の一時的な麻酔のための統合されたisofロリン装置と誘導室が含まれています。よし、俺には自分がある。次に、in vitroバイオルミネッセンスイメージングに移りましょう。

in vitro生物発光イメージングでは、無菌状態を維持することが重要です。したがって、イメージングシステムは、できれば細胞培養室で、無菌状態であるべきです。イメージングする前に、細胞培地を取り出し、細胞を覆うのに十分なPBSを添加します。

例えば、ヒト胚性幹細胞培養物を含む6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのPBSを添加します。デリンとPBSの比率は1対100である必要があります。したがって、6つのウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルの解凍デリンを追加します。

あなたの文化に追加する前に、デリンをフィルタリングすることを忘れないでください。1分待ってから、プレートをチャンバーに入れ、10秒の露光時間で画像を撮影し、露光時間を調整します。シグナルが飽和しているか弱すぎる場合、生物発光シグナルは細胞数を反映するため、シグナルを異なる細胞数と相関させる定量アッセイを行うことができます。

これらは、一般的な定量アッセイから取得した画像です。左上には、ヒト胚性幹細胞コロニーの明るいフィールドがあります。これらの細胞は、事後に緑色に蛍光を発するため、レポーター遺伝子を持っていることがわかっています。

ブルーカラーの選別はダサいシミです。下のパネルは、細胞の数が増えている文化的な井戸を示しています。このグラフに見られるように、細胞数は生物発光シグナルと相関しています。

この相関関係により、in vivoでの細胞増殖を追跡するための半定量的アッセイが得られます。さて、それがin vitroの手順です。次に、in vivo生物発光イメージングに移りましょう。

奇形腫形成を生体内で画像化するために、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するヒト胚性幹細胞をスキッドマウスの背部に注入し、IVUシステムで生物発光画像を撮影します。細胞を移植する準備ができたら、椎間板スペースまたはコラゲナーゼを使用して細胞を数回緩め、成長因子、還元性マトリゲル、およびDMMの1対1の混合物にそれらを懸濁します。通常、最初に細胞を冷却したDMMと混合し、次にマトリゲルを追加します。

皮下部位ごとに、50〜100マイクロリットルのマトリゲルDMM混合物に懸濁した200,000個の細胞を注入します。セル番号は、アプリケーションに応じて調整できます。注射する前に、すべてを氷の上に置いておくことを忘れないでください。

細胞の準備ができたら、マウスを誘導ボックスに入れて麻酔をかけます。イソフッ素の流れがオンの場合。約1分後、マウスに麻酔をかけ、連続イソフッ素を投与して手術台に載せることができます。

自然に自己蛍光を発し、生物発光画像を不明瞭にする可能性があるため、マウスの裏側から毛を取り除く必要があります。これを行う最も簡単な方法は電気シェーバーを使用することですが、脱毛ジェルを使用し、アルコールで拭いて後で皮膚を滅菌することもできます。次に、シリンジに100マイクロリットルの細胞懸濁液を23〜27ゲージの針で描くと、細胞が詰まらないため、最適に機能します。

次に、皮膚がかなり緩んでいるため、皮膚の下の細胞をマウスの背中に注入します。親指と人差し指を使って、注入したい領域をつまんで伸ばします。皮膚のすぐ下に注入し、深く穴を開けすぎないように注意してください。

また、プランジャーを押し下げながら、針が注射部位から滑り落ちないようにしてください。これにより、細胞が漏れる可能性のある穴が皮膚に作られるのを防ぐことができます。細胞を注入した後で再度注入を試みる場合は、マウスが目を覚まし、走り回るのを数時間待ってから、マウスをスリープ状態に戻します。

生物発光イメージングでは、そうすることでイソフルランの毒性を回避できます。さて、これで、注入した細胞のin vivo生物発光イメージングに進む準備が整いました。次のイメージング研究では、すでに奇形腫の形成が始まっているマウスを使用して、全動物生物発光イメージングを行います。

ルシファーの腹腔内注射を体重1キログラムあたり375ミリグラムで行います。したがって、私たちは投与量を計算するために麻酔をかけた動物の体重を量り、正中線のすぐそばの腹膜に証書ルシファーを注入し、針を引き戻し、血液がないことを確認する必要があります。マウスが目を覚まし始めたら、マウスを誘導チャンバーに戻し、1〜2分待ちます。

イメージングの準備として、つや消しの黒い紙をイメージングボックスに入れ、ヒト胚性幹細胞から放出されない光を吸収します。マウスの場合、最大生物発光シグナルは通常、注射後15〜40分で発生します。したがって、10〜15分後、マウスの裏側を上にして、イソフッ素を含むイメージングチャンバーに置きます。

露光時間を 10 から開始します。信号が飽和している場合は、露光時間を短くしてみてください。弱すぎる場合は、露出を増やします。

信号の露光時間がマウスに最適化されたら、信号が最大に達するまで毎分画像の撮影を開始します。これは、イメージングソフトウェアを使用して、注入部位をカバーする関心領域を選択することによって行うのが最適です。各関心領域の信号強度を監視することで、信号が減少し始めるタイミングを簡単に判断でき、最大信号強度に達したことを示すことができます。

最大値付近で発生する 3 つの連続した画像の平均を取り、それを最終的な値として使用します。画像に満足したら、マウスをisofフッ素から取り出し、ケージ内で目を覚ますのを待ちます。通常、マウスは15分以内にウェイクアップします。

所望の時間経過の後、生物発光画像が取得される。動物は、組織学に使用される組織切片で犠牲にされる場合があります。さて、in vivoイメージングの手順が完了したので、結果を詳しく見て、また私たちの研究室からの以前の研究をいくつか見てみましょう。

皮下奇形腫を患ったマウス3匹の生物発光画像です。生物発光シグナルデータは、イメージングソフトウェアによって自動的に行われたマウスの白黒写真に重ね合わせられています。これは、ホタルルシフェラーゼで可能な縦方向のイメージングの一例です。

この場合、最初の注射後にヒト胚性幹細胞を直接心臓に注入しました。ほとんどの細胞は、心臓の生物発光の減少によって示されるように、次の週に死滅します。黒い矢印に注意してください。

移植を生き残ったヒト胚性幹細胞は、最終的に心臓に奇形腫を形成し、14日目頃から急速に増加するシグナルとして視覚化できます。7日目には、赤い矢印で示されている生物発光の2番目の領域があり、ヒト胚性幹細胞の腹部への余分な心臓漏出を示していることに気付くでしょう。これは非常に一般的です。

ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現するヒト胚性幹細胞の生物発光画像をin vitroおよび生きたマウスに移植した後の両方で取得する方法を示しました。この方法により、組織学のために多数の動物を犠牲にすることなく、細胞増殖の反復的なイメージングとモニタリングが可能になります。これは、細胞定量にとって本質的に不正確である可能性があります。マウスでこの手順を行うときは、正しい濃度のdelucciを使用し、露出間隔が長すぎると生物発光画像が飽和しないようにすることが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。