複雑なタンパク質混合物から個々のタンパク質を分離することは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）として知られるゲル電気泳動によって達成できます。タンパク質は、電界に応答してゲルマトリックスの細孔内を移動します。ゲルの細孔サイズと、タンパク質の電荷、サイズ、および形状の組み合わせによって、タンパク質の移動速度が決まります。このビデオでは、タンパク質の電気泳動による分離方法を実演します。

こんにちは。Keck Graduate Institute of Applied Life SciencesのプロテオミクスセンターのBobul Chakravarti博士です。本日は、1Dゲル電気泳動の手順について解説します。それでは始めましょう。

まず、メーカーの指示に従い、2枚の清潔なガラスプレートと2枚の1.5 millimeterスペーサーを使用して、電気泳動装置のガラスプレートサンドイッチを組み立てます。次に、ガラスプレートサンドイッチをキャスティングスタンドに固定します。続いて、現在のプロトコルに記載されている分離ゲルの溶液を調製します。

規定量の10%硫酸アンモニウムとTEMEDを溶液に加え、穏やかに撹拌して混ぜ合わせます。アクリルアミド濃度が高いため、脱気は不要です。10 mL使い捨てプラスチックピペットを用い、ガラスプレート間の溶液の高さが約11 cmになるまで、分離ゲルの溶液をスペーサーの一方の端に沿って直ちにサンドイッチに注入します。

次に、別のピペットを用いて、ゲルの上部を厚さ約1 cmの水飽和イソブチルアルコールまたは蒸留水の層でゆっくりと覆います。この際、スペーサーの一方の端、次にもう一方の端に沿って水を静かに重ね、ゲルを30〜60分間重合させます。室温において、この水層を重ねることで、アクリルアミドゲルが直線的に重合することが保証されます。

ゲルの重合が完了したら、スタッキングゲルの注入準備が整ったことになります。まず、蒸留水の層を捨て、pH 8.8の1x Tris-Cl in SDSで洗浄します。次に、現在のプロトコルに従ってスタッキングゲル溶液を調製します。

次に、プラスチック製ピペットを使用して、スタッキングゲルの溶液をスペーサーの端に沿ってサンドイッチの中央にゆっくりと滴下し、溶液の高さがプレートの上端から約1 cmになるまで注入します。スタッキングゲル内に気泡が入らないように注意してください。ゲルの注入が完了したら、0.75 mmのテフロン製コームをスタッキングゲル溶液の層に挿入します。

スタッキングゲルの溶液を室温で30〜45分間重合させます。これでタンパク質サンプルの調製が可能です。タンパク質サンプルの調製を開始します。分析するタンパク質サンプルの一部を、2X SDSサンプルバッファーを用いて1:1の比率で希釈します。

希釈したタンパク質溶液の場合、タンパク質と6×SDSサンプルバッファーを5:1の割合で混合することを検討してください。サンプルが沈殿したタンパク質ペレットである場合は、1×SDSサンプルバッファー50〜100 µLでタンパク質を溶解させます。次に、密封したスクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブに入れ、ウォーターバスを用いて100 °Cで3〜5分間、サンプルを加熱します。

次に、ポリアクリルアミドウェルの端を破かないように注意しながら、テフロンコームを慎重に取り除きます。コームを取り除いた後、ウェルを1X SDS電気泳動バッファーで洗浄します。その後、ピペットを用いて、ウェルに1X SDS電気泳動バッファーを満たします。

ウェルを洗浄し、バッファーを満たした後、ゲルサンドイッチを上部バッファーチャンバーに取り付けます。製造元の指示に従い、下部バッファーチャンバーに推奨量の1×SDS電気泳動バッファーを満たします。次に、上部バッファーチャンバーに取り付けたサンドイッチを下部バッファーチャンバーに入れます。

次に、スタッキングゲルのサンプルウェルまでバッファーが満たされるように、上部バッファーチャンバーに1×SDS電気泳動バッファーを完全に満たします。これでゲルの準備が完了しました。25 µLまたは100 µLの自動ピペッターとゲルロードチップを使用して、サンプルをウェルの底に薄い層になるように慎重に注入し、1つまたは複数のウェルにタンパク質サンプルをロードします。コントロールウェルには分子量標準をロードします。

隣接するレーンの広がりを防ぐため、空のウェルに等量の1X SDSサンプルバッファーを加えます。これでゲル電気泳動を開始する準備が整いました。ゲルを流すには、電源をセルに接続し、厚さ1.5 mmのスラブゲルの場合は30 mAの定電流で泳動させます。

メンソールブルーのトラッキング染料が分離ゲルの底部に到達した後、電源を切断します。ゲルの電気泳動が完了したので、電気泳動バッファーを廃棄し、ゲルサンドイッチが装着された上部バッファーチャンバーを取り出します。サンプルウェルの順序がわかるようにゲルの向きを確認してください。

次に、サンドイッチを上部バッファーチャンバーから取り出し、吸水紙またはペーパータオルの上に置きます。続いて、スペーサーの片方を、サンドイッチの端から全長にわたって半分ほど慎重にスライドさせます。露出したスペーサーをレバーとして使い、ガラスプレートをこじ開けて、ゲルを慎重に露出させます。

下プレートからゲルを取り出します。染色および乾燥中にレーンの向きが分からなくならないよう、ゲルの片方の角を小さな三角形に切り落とします。これでゲル電気泳動の手順は完了です。

これで、様々なタンパク質検出の手法を用いてゲルを処理することができます。ここでは、ゲル電気泳動を用いてタンパク質を分離する方法について説明しました。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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概要

このビデオでは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いたタンパク質の電気泳動分離法について解説します。この手法により、複雑な混合物から個々のタンパク質を、その電荷とサイズに基づいて分離することが可能です。

研究の主要構成要素

科学分野

生化学
プロテオミクス
電気泳動

背景

ゲル電気泳動は、タンパク質を分離するために広く用いられている手法です。
タンパク質は電場に応答してゲルマトリックス中を移動します。
移動速度は、タンパク質の電荷、サイズ、および形状によって影響を受けます。
ポリアクリルアミドゲルは、この分離に適した媒体となります。

研究目的

一次元ゲル電気泳動の手順を実演する。
PAGEを用いたタンパク質分離の原理を説明する。
当該分野の研究者に視覚的なガイドを提供する。

使用した手法

ポリアクリルアミドゲルの調製。
タンパク質サンプルのゲルへのアプライ。
電場を印加し、タンパク質の移動を促進させる。
電気泳動後、分離したタンパク質の可視化。

主な結果

サイズと電荷に基づいたタンパク質の分離の成功。
電気泳動プロセスのリアルタイムでの実演。
電気泳動後におけるタンパク質バンドの視覚的表現。
タンパク質分析におけるPAGEの有効性の考察。

結論

PAGEはタンパク質分離のための有効な手法です。
この技術はプロテオミクスにおけるさまざまなアプリケーションに利用可能です。
電気泳動の原理を理解することは、研究者にとって極めて重要です。

よくある質問

ポリアクリルアミドゲル電気泳動とは何ですか？

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、タンパク質をそのサイズと電荷に基づいて分離するために用いられる手法です。

PAGEにおいて、タンパク質の移行はどのように起こりますか？

タンパク質は電場に応じてゲルマトリックス内を移動し、その移動速度はサイズと電荷によって影響を受けます。

PAGEの用途は何ですか？

PAGEは、純度評価、分子量決定、タンパク質の特性解析を含む、タンパク質分析に一般的に使用されています。

PAGEにおけるタンパク質の移動に影響を与える要因は何ですか？

タンパク質の移動度は、そのサイズ、電荷、およびゲルマトリックスの孔径によって影響を受けます。

PAGEはすべての種類のタンパク質に適していますか？

PAGEは幅広いタンパク質に適していますが、ゲルの濃度はタンパク質のサイズによって異なります。

業界における重要性

タンパク質の電気泳動分離により、複雑な混合物を個々の成分に分離して機能解析を行うことができるため、初期段階でのターゲットバリデーションが可能になります。この手法は、サブユニットの精密な特性評価と均一性評価を通じてメカニズムのデリスキングを支援し、リード同定におけるゴー/ノーゴー判断に寄与します。その再現性とスケアラビリティは、変性条件下でのタンパク質の挙動に関する定量的な意思決定可能なデータを提供することで、ポートフォリオのトリアージを効率化します。