ゲルでタンパク質を染色

「Electrophoretic Separation of Proteins」と題した以前のビデオでは、ゲル電気泳動を使用してタンパク質の複雑な混合物を分離する方法を示しました。このビデオでは、ゲル中のタンパク質の位置を視覚化するための4つの異なるゲル染色方法を紹介します。こんにちは、私はUVPのSean Gallagherで、KEG大学院研究所のプロテオミクスセンターで働いています。

電気泳動による分離後のタンパク質を可視化するためのいくつかのテクニックを紹介します。これには、カマシブルーシルバー染色、サイロオレンジ、サイロルビーが含まれます。それでは、まずカマシブルーから始めましょう。

Kamasi blue染色によるゲル中のタンパク質禁止化合物の検出は、色素の非特異的結合に依存します。この場合は、カマシブリリアントブルーGツー50です。この方法では、ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を高純度の水で洗浄します。

次に、タンパク質の位置を水性のカマシブルー染色剤を使用して検出します。検出限界は、タンパク質バンドあたり0.3〜1マイクログラムです。まず、電気泳動によってタンパク質を分離したポリアクリルアミドゲルから始めます。

攪拌しながら、300ミリリットルの高純度水で満たされたプラスチック容器にポリアクリルアミドゲルをゆっくりと入れます。5分間放置します。3回目の洗浄後、廃棄してさらに2回繰り返します。

水を注ぎ、ゲルにカマシブルー染色液を1時間含ませ、1時間染色後ゆっくりと攪拌しながら、染色液を注ぎます。約200ミリリットルの水に30分間入れて、ゲルを短時間すすぎます。この時点で、ゲルは将来のイメージングのために水中に保存することができます。

ゲルは、永久的なゲル記録を維持するために、この段階で乾燥させることもできる。これを行うには、ゲルを2枚のWatman 3 mm濾紙に置き、上部をラップで覆います。その後、従来のゲルドライヤーで約80°Cで1〜2時間乾燥させます。

また、タンパク質染色の方法として、次にご説明いたしますが、銀染色も可能です。カマシブルー染色法はより簡単で迅速ですが、銀染色は検出限界が0.3ナノグラムBSAとかなり感度が高くなります。銀染色によるゲル中のタンパク質バンドの検出は、タンパク質中のさまざまな化学基への銀の結合に依存します。

以下のプロトコールは、in Vitrogen の Silver Quest 銀染色キットに基づいています。このプロトコールは、約30分という高速染色プロトコールから導き出され、質量分析に適合した銀染色に使用される多くのキットベースのケミストリーの1つを表しています。この場合、銀染色を開始する前に、in vitrogen プレキャストミニゲルを使用します。

指紋の汚染を避けるために、常に手袋を着用してください。100ミリリットルの試薬グレードの水を入れた電子レンジ対応トレイにゲルを置きます。短時間すすぎ、次に水を注ぎます。

次に、40%エタノール、10%酢酸からなる100ミリリットルの固定剤を高純度水に添加し、電子レンジで30秒間加えます。マイクロ波プロセスは、結合と染色を加速することにより、必要なインキュベーションステップを短縮します。この時点で、ジェルをシェーカーに置き、5分間ゆっくりと揺らします。

5分後、固定剤を注ぎ、100ミリリットル、30%エタノールを加えてゲルマイクロ波を30秒間洗浄し、次にゲルをシェーカーに5分間置きます。5分後、エタノールを注ぎます。次に、100ミリリットルの増感試薬を電子レンジで30秒間加え、次にシェーカーに2分間置きます。

2分後、増感試薬を注ぎます。100ミリリットルの試薬グレードの水電子レンジを30秒間加え、シェーカーに2分間置きます。注ぎ、合計2回の洗浄サイクルを繰り返します。

次に、100ミリリットルの染色液を加え、電子レンジで30秒間加熱し、5分間ゆっくりと攪拌します。5分後、染色液を注ぎます。100ミリリットルの試薬グレードの水を加え、電子レンジをスキップし、ステップして20〜60秒間シェーカーに直接置きます。

水を捨て、すぐに100ミリリットルの現像液を加え、タンパク質バンドが見えるまで現像します。背景が鮮明なままの場合、これには約5〜10分かかります。この時点で、現像液に10ミリリットルのストッパー溶液を追加して、最良の結果を得るために開発を停止します。

色の濃さがわずかに変化し、非特異的な背景要素が増加する可能性があるため、できるだけ早くゲルを撮影してください。時間が経つにつれて、あなたが見ているゲルには残留タンパク質が含まれていますエレクトロブロッティング後、ゲルを乾燥させて永久的な記録を維持するか、密封可能なビニール袋に保管します。次に、ゲルを蛍光染色する方法を実演します。

蛍光色素には、従来のタンパク質染色剤に比べて多くの利点があります。ここで概説するCiproオレンジタンパク質ゲル染色剤は、バンドごとに1〜2ナノグラムのタンパク質を検出できます。これは、カマシブリリアントブルー染色よりも感度が高く、多くの銀染色技術と同じくらい感度が高いです。

蛍光染色は、一般的な銀染色プロトコルよりも手作業が少なく、1時間以内に完了します。染色されたタンパク質は、標準的な300ナノメートルUVトランスルミネーターまたはレーザースキャナーを使用して視覚化できます。この場合、再びin vitrogenプレキャストミニゲルを使用して、SDSページを使用してタンパク質の調製と分離を開始します。

ただし、バックグラウンド蛍光を減らすために、通常の0.1%SDSではなく、ランニングバッファーで0.05%SDSを使用してください。染色手順を開始するには、1つまたは2つの標準サイズのミニゲル用の小さなプラスチック皿にciproオレンジ蛍光染色溶液を注ぎます。約50ミリリットルの染色液を使用してください。

汚れた食器は、洗剤が汚れを妨げるため、使用前によく洗浄してすすぐ必要があることに注意することが重要です。次に、ゲルを染色液に入れます。明るい光から染料を保護するために、容器をアルミホイルで覆います。

ゲルを室温で40〜60分間穏やかに撹拌します。染色溶液を廃棄し、次いで7.5%酢酸、約100ミリリットルでゲルを1分未満すすぎ、ゲル表面から余分な汚れを除去し、0.1%tween 20で一晩インキュベートしてゲルを留置し、タンパク質バンドを視覚化し、撮影する。蛍光標識ゲルを標準的な300ナノメートルトランスルミネーターまたはブルーライトトランスルミネーターに直接置きます。

次に、Ciproルビー蛍光色素を用いた代替の蛍光染色法を実演します。Ciproルビー染色法は、特に2次元ページで使用するために設計されましたが、標準的な1次元SDSページで最も感度の高いタンパク質ゲル染色であることが証明されています。まず、ゲルを適切なサイズの清潔なポリプロピレンまたはPVC皿に移します。

50 RPMsでオービタルシェーカー上で連続的に穏やかに攪拌しながら、適量の希釈されていないcipro Rubyタンパク質ゲル染色液でゲルをインキュベートし、ゲルを覆い、少なくとも3時間インキュベートします。ゲルを清潔な染色皿に移し、10%メタノール、7%酢酸溶液で1回洗い、ゲルを回収してロッカーに30分間戻します。

バックグラウンド蛍光を低減し、感度を高めるために、ゲルを表示および撮影する準備が整いました。本日は、本日の議定書をご覧いただき、誠にありがとうございます。電気泳動後のタンパク質を視覚化するためのさまざまな手順を紹介しました。

蛍光染色や銀染色など非常に敏感なものもあれば、カマシブルー染色のように日常的なものもあります。試薬の純度が重要であることを覚えておくことが重要です。超純水を使うこともとても大切ですし、一つ一つのステップのタイミングも大切です。

再現性のある結果を得るためには、その点にも細心の注意を払う必要があります。以上で、次回の一連の実験で頑張ってください。