ゲルでタンパク質を染色

以前の「タンパク質の電気泳動分離」というビデオでは、ゲル電気泳動を用いてタンパク質の複雑な混合物をどのように分離できるかを示しました。このビデオでは、ゲル内のタンパク質の位置を可視化するための4つの異なるゲル染色法を紹介します。こんにちは、KEG大学院研究所のプロテオミクスセンターで活動しているUVPのショーン・ギャラガーです。

本日は、電気泳動による分離後に行うタンパク質の可視化のためのいくつかの手法をご紹介します。これには、クマシーブルー染色、シルバー染色、Cyro OrangeおよびCyro Rubyが含まれます。まずはクマシーブルーから始めていきましょう。

クマシーブルー染色によるゲルのタンパク質バンドの検出は、染料の非特異的な結合に基づいています。ここでは、クマシーブリリアントブルーG-250を使用します。この方法では、ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を高純水で洗浄します。

次に、水溶性クマシーブルー染色を用いてタンパク質の位置を検出します。検出限界は、1タンパク質バンドあたり0.3〜1 µgです。まず、電気泳動によってタンパク質が分離されたポリアクリルアミドゲルを用意します。

ゆっくりと撹拌しながら、300 mLの高純度水を満たしたプラスチック容器にポリアクリルアミドゲルを入れます。5分間放置してください。その後、液を捨て、同様の洗浄操作をさらに2回繰り返します。

水を捨て、ゲルをCoomassie blue染色液で覆い、ゆっくりと撹拌しながら1時間染色します。染色後、染色液を捨てます。約200 mLの水に30分間浸し、ゲルを短時間洗浄します。この時点で、ゲルを水に浸したまま保存し、後でイメージングを行うことができます。

また、永久的なゲルの記録を保持するために、この段階でゲルを乾燥させることができます。乾燥させるには、ゲルを2枚のWatman 3 mmフィルターペーパーの上に置き、上部をプラスチックラップで覆います。その後、一般的なゲル乾燥機を用いて、約80 °Cで1〜2時間乾燥させます。

もう一つのタンパク質染色法として、次に実演する銀染色があります。クマシーブルー染色法の方が簡便で迅速ですが、銀染色は検出限界が0.3 nanograms BSAとかなり感度が高くなります。銀染色によるゲル中のタンパク質バンドの検出は、タンパク質内のさまざまな化学基への銀の結合に基づいています。

以下のプロトコルは、Invitrogen社のSilver Questシルバー染色キットに基づいています。このプロトコルは、約30分で完了する高速染色プロトコルから派生したものであり、質量分析法に対応したシルバー染色に使用される多くのキットベースの化学的手法の一つです。本手順では、シルバー染色を開始する前に、Invitrogen社のプレキャストミニゲルを使用します。

指紋による汚染を防ぐため、常に手袋を着用してください。ゲルを、100 millilitersの試薬グレードの水を入れた電子レンジ対応のトレイに置きます。短時間すすいだ後、水を捨てます。

次に、高純度水に40%エタノールと10%酢酸を配合した固定液を100 milliliters加え、30秒間マイクロ波照射します。マイクロ波処理により、結合と染色の速度が高まり、必要なインキュベーションステップを短縮できます。この時点で、ゲルをシェーカーに載せ、5分間ゆっくりと揺らします。

5分後、固定液を捨て、洗浄のために100 mLの30% ethanolを加え、30秒間電子レンジで加熱し、その後シェーカーで5分間振とうします。5分後、ethanolを捨てます。次に、100 mLの感度向上試薬を加え、30秒間電子レンジで加熱し、その後シェーカーで2分間振とうします。

2分後、感作試薬を捨てます。試薬グレードの水100 mLを加え、電子レンジで30秒間加熱し、シェーカーで2分間振盪させます。液を捨て、この洗浄工程を計2回繰り返します。

次に、100 millilitersの染色液を加え、30秒間電子レンジで加熱し、5分間ゆっくりと攪拌します。5分後、染色液を捨てます。100 millilitersの試薬水（reagent grade water）を加え、電子レンジでの加熱ステップは飛ばして、直接シェーカーに載せ、20から60秒間振盪します。

水を捨て、直ちに100 mLの発色液を加え、タンパク質バンドが見えるまで発色させます。背景がクリアな状態を保つには、約5～10分かかります。この時点で、最適な結果を得るために、10 mLの停止液を発色液に加えて発色を停止させます。

色の強度がわずかに変化したり、非特異的なバックグラウンド要素が増加したりする可能性があるため、できるだけ早くゲルの写真を撮影してください。時間の経過とともに、エレクトロブロッティング後のゲルには残留タンパク質が含まれます。恒久的な記録として保持する場合はゲルを乾燥させ、または密閉可能なプラスチック袋に入れて保存してください。次に、ゲルの蛍光染色法について説明します。

蛍光染料は、従来のタンパク質染色法に比べて多くの利点があります。本稿で解説するCipro orangeタンパク質ゲル染色では、1バンドあたり1〜2ngのタンパク質を検出することが可能です。これはクマシーブリリアントブルー染色よりも感度が高く、多くの銀染色法と同等の感度を備えています。

蛍光染色は、一般的な銀染色プロトコルよりも手技に要する時間が短く、1時間以内に完了するため簡便です。染色されたタンパク質は、標準的な300 nm UVトランスイルミネーターまたは laserscanner を用いて可視化できます。本手順では、再度 Invitrogen 社の Precast Mini Gel を使用し、SDS-PAGE によるタンパク質の調製および分離を行います。

ただし、背景蛍光を低減させるため、ランニングバッファーには通常の0.1%SDSではなく0.05%SDSを使用してください。染色手順を開始するには、標準サイズのミニゲル1～2枚分が入る小さなプラスチック製ディッシュに、cipro orange蛍光染色溶液を注ぎます。染色溶液は約50 milliliters使用してください。

染色皿は、洗剤が染色を妨げるため、使用前に十分に洗浄し、すすいでおくことが重要です。次に、ゲルを染色液に入れます。染料を強い光から保護するため、容器をアルミホイルで覆います。

室温で40～60分間、ゲルを緩やかに撹拌します。染色液を廃棄し、次に7.5% 酢酸（約100 mL）で1分未満にわたりゲルを洗浄して、ゲル表面の余分な染料を除去します。タンパク質バンドを可視化し撮影するため、0.1% Tween 20の中で一晩インキュベートしてゲルを脱染します。蛍光標識されたゲルを、標準的な300 nmトランスイルミネーターまたはブルーライトトランスイルミネーターの上に直接置きます。

次に、Cipro ruby蛍光染料を用いた代替的な蛍光染色法を実演します。Cipro ruby染色法は特に2次元電気泳動での使用を目的に設計されましたが、標準的な1次元SDS-PAGEにおいて最も感度の高いタンパク質ゲル染色法であることが証明されています。まず、ゲルを適切なサイズの清潔なポリプロピレン製またはPVC製のディッシュに移します。

適切な量の未希釈のcipro ruby protein gel stainにゲルを浸し、オービタルシェーカーを用いて50 RPMで緩やかに連続的に攪拌しながらインキュベートします。ゲルをカバーで覆い、少なくとも3時間インキュベートします。ゲルを清潔な染色皿に移し、10%methanol、7%acetic acid溶液で1回洗浄した後、回収して再びロッカーに戻し、30分間静置します。

バックグラウンドの蛍光を抑え感度を高めるため、これでゲルの観察および写真撮影の準備が整いました。本日のプロトコルをご視聴いただきありがとうございました。電気泳動後のタンパク質を可視化するためのさまざまな手法をご紹介しました。

蛍光染色や銀染色などの非常に感度の高いものもあれば、クマシブルー染色のような日常的なものもあります。試薬の純度が極めて重要であることに留意してください。また、超純水の使用および各ステップの処理時間も非常に重要です。

再現性のある結果を得るためには、その点に細心の注意を払う必要があります。以上です。次回の実験がうまくいくことを願っています。