抗酸菌のエレクトロポレーション

マイコバクテリアの病原性戦略は、ほとんどの種で増殖速度が遅いため、まだよくわかっていません。細胞壁の侵入不可能な性質と病原体を扱うことの危険性は、マイコバクテリアの研究を困難にし、これらの生物に対する私たちの理解不足の主な原因となっています。このビデオでは、細胞に短時間で高い電気インパルスをさらすエレクトロポレーションの技術を示し、DNAの侵入を可能にします。

これは、マイコバクテリア細胞にDNAを導入するために最も広く使用されている方法です。こんにちは、私はバッツの感染症センターとロンドン医科歯科大学のターニャ教区研究室のロングッドです。今日は、電気操作微生物の手順をお見せします。

当研究室では結核菌の研究を行っていますが、結核菌は病原性が高く、C3封じ込め施設が必要なため、この手法を非病原性微生物m Mcmaで紹介します。そこで、バクテリアを電気で食べてみましょう。マイコバクテリアを食べるためには、有能な細胞を作る必要があります。

病原性マイコバクテリアは重要なバイオハザードであることを覚えておくことが重要です。したがって、すべての培養および遺伝子操作は、適切な封じ込め内で実施されなければなりません。クラス1の安全キャビネット内の施設 リスク評価は、病原性マイコバクテリアの実験の最初の部分を形成する必要があります。

これらを作るために、私たちは、そのようなレムコ、オーガー接種、マイコバクテリアでいっぱいのループとトゥイーンブロスを含む5ミルのレムコなどの固体培地で実験室で維持されている培養から始めます。多くのマイコバクテリアは比較的成長が遅いため、マイコバクテリアを急速に超える可能性のある真菌のバクテリアでこれらの培養物が汚染されるのを防ぐために、生物は優れた無菌技術を維持することが非常に重要です。多くの場合、1つが汚染された場合に備えて、重複した培養を設定するのが賢明です。

マイコバクテリア細胞は、ワックス状の厚い被膜のために、培養中に凝集する傾向があります。ボルテックスとTween 82培地などの非イオン性界面活性剤の添加により、この凝集が減少し、細胞のより均質な懸濁液が得られます。接種後、培養物を摂氏37度でインキュベートし、100RPMで一晩振とうします。

スターター培養が成長した後、250ミルの円錐形フラスコに約100ミルのレムコtwの大規模培養物を接種し、一晩培養の1〜100希釈します。摂氏37度で約16〜24時間振とうしながらインキュベートを続け、その際に分光光度計で光学濃度を確認できます。0.8から1と読み取られた場合、細胞は成長の最適な対数段階にあります。

その後、細胞を氷上で1.5時間インキュベートしてから回収すると、形質転換効率が4倍に向上します。長い。氷上でのインキュベーションは効率の低下につながります。次に、培養物を大きな遠心分離チューブに注いで細胞を回収します。

遠心分離後10分間300Gで回転し、氷冷で細胞を3回洗浄し、10%グリセロールは、100食の培養量のために、20食が最初の洗浄に使用され、次に10ミル、最後に最後の洗浄のために5ミルが使用されるように、毎回容量を減らします。洗浄後、細胞を元の氷冷量の1〜10〜100に懸濁します。10%グリセロール この段階では、細胞を分注し、凍結し、将来の使用のために摂氏マイナス70度で保存することができます。

形質転換効率は、細胞を凍結した後に増加することがよくあります。これらのコンピテントセルを使用する前に、解凍し、遠心分離で回収し、使用前に新鮮な10%グリセロールに再懸濁する必要があります。エレクトロパレードを行うために、2.5の高電圧パルスを供給できる装置であるems mag an electro。

キロボルトが使用されます。細菌とDNAはエレクトロポレーション、キュベットに入れられます。また、ギャップやパスの長さは異なるキュベットで同じであっても、保持できる体積によって異なります。

私たちは日常的に200マイクロリットルの細胞を0.2センチメートルのqveで使用して細胞を食べます。まず、DNAサンプルに塩分やその他の汚染物質が含まれないように調製します。これは、エレクトロポレーション中にアーク放電が発生する可能性を最小限に抑えるために重要です。

バクテリアを捕捉する前に、DNAサンプルが高純度であることを確認してください。2つの60対2の80吸収剤の比率は1.8に近いべきです。200マイクロリットルの微生物懸濁液に5マイクロリットル以下の容量で0.5〜5マイクログラムの無塩DNAを添加すると、抗生物質耐性変異体の頻度をチェックするためのDNAを含まない制御エレクトロポレーションを含めることができます。

次に、ミックスを氷の上に10分間置きます。これにより、サンプル中の生命細胞とDNA溶液中の塩の存在が減少し、アイスインキュベーション後のアーク放電が最小限に抑えられ、高電圧パルスの前にピペットまたはボルテックスで細胞を完全に再分配して細胞を再懸濁し、DNAの混合を確保します。細胞が凝集すると、アーク放電が発生し、形質転換効率が低下します。

次に、混合物を予め冷却した0.2センチメートルの電極gab qveに移します。繰り返しになりますが、ミックスに泡を入れないように注意してください。また、アーク放電を減らすため。

qveの外側が完全に乾いていることを確認してから、パルスチャンバーに入れてください。qveを完全に乾燥させ、パルスコントローラーの抵抗を1000Ωに設定して、qveをエレクトロポレーションチャンバーに入れます。次に、電圧を2.5キロボルトに設定した後、QVEのコンデンサが放電したことを示すビープ音が鳴るまでパルスを印加します。

時定数が10より大きい場合は、エレクトロポレーションが成功したことを示します。エレクトロポレーションの失敗は通常、アーク放電によって示され、火花が発生しますが、これは多くの場合回避できます。パルスコントローラーの抵抗を変更して、Q vetを氷上に10分間戻します。

インキュベーション後、細胞懸濁液を5ミルのlemko TWブロスが入った滅菌ユニバーサルボトルに移します。細胞の回復を助け、形質転換体の生存率を高めるためには、パルスの直後に細胞を少なくとも10倍に希釈することが重要です。次に、細胞を摂氏37度で2〜3時間インキュベートし、インキュベーション後に播種する準備ができたら、3000Gで10分間遠心分離して細胞を回収します。

遠心分離後、各プレートが30〜300コロニーを得るように、レムコブロスで懸濁液を適切に希釈します。耐性コロニーが単一の細胞から生じたことを確認することが重要であるため、プレーティングする前に細胞が完全に再懸濁されていることを確認してください。細胞が希釈されていない場合、背景に対して真に耐性のあるコロニーを視覚化することは非常に困難になる可能性があります 敏感な細胞の芝生は、適切な抗生物質を使用してレムコオーガー上の細胞をプレートアウトします。

彼らは、コロニーが見えるまでプレートを摂氏37度でインキュベートします。これには、コロニーが成長してから3〜5日かかります。トランスフォーマーを数えます。

変換効率を計算するため。トランスフォーメーションの効率には、いくつかの要因が影響します。これらには、エレクトロポレーション培地を採取したときの細胞の成長段階、および送達されたパルスの電界強度と時定数が含まれます。

エレクトロポレーション技術の効率は、形質転換のためのDNAの選択、場合によっては選択可能なマーカーの選択にも依存します。私たちは、マイクログラムあたり10から5番目、10から6番目のコロニー、DNAの効率を日常的に取得し、EMSマグマのハイグロマイシンまたはストレプトマイシン耐性を使用します。次に、トランスフォーマントを成長させるために、エレクトロポレーションされたマイコバクテリアを固体培地プラス選択に連鎖させます。

抗生物質は37度で2〜3日間インキュベートします。2〜3日間のインキュベーションの後、ほとんどのアプリケーションで必要に応じて形質転換体を分析できますが、3つの形質転換体をストリークアウトして分析する必要があります。形質転換後の余分な染色体プラスミドの同一性を確認することが重要です。

欠失や再配置がよくあるので、マイコバクテリウムのマグマを電解質する方法をお見せしました。病原性微生物を使用してこの手順を行う場合は、適切な安全対策を講じることを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。