Name: マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-09T01:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶマウス髭毛囊からの表皮神経堤幹細胞（EPI-NCSC）分離培養法。微小解剖で隆起部を取り出し、組織培養で3〜4日後に細胞遊出を観察する技術を解説。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

、南東部ウィスコンシン州のバイオメディカルテクノロジーアライアンス、Milwauke、WI、アメリカ合衆国、バイロンリーシュ麻痺財団、ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国、イーグルスの友愛会、中西部章USPHS助成NS38500、神経疾患や脳卒中の国立研究所、NIH、米国後援： 、米国、国立脊髄損傷協会、ミルウォーキー章、米国、北東イングランド幹細胞研究所、ニューカッスル大学、英国。

成体マウスのウィスカの卵胞からバルジの解剖<ol><li>我々は、10週間〜6ヵ月齢のマウスを使用してください。若いマウスでは、しばしば複数のセルをもたらす。 betadine（ヨウ素溶液）と約3分間過酸化水素（薬局から入手可能）の1:1混合物中にマウスと水没全体の動物を安楽死させる。 </li><li>潮吹き全体、特にマウス、顔領域、75％エタノールで、そして層流フードで解剖顕微鏡にマウスを運ぶ。 </li><li>慎重に毛の球根にカットし、HBSSでプールを避け、ウィスカーパッドを解剖。 </li><li>室温でのHBSSでウィスカの卵胞とプールを細かく分析。ピンセットで毛包に次のスキンを保持し、ストレートはさみで卵胞の周りにカットすることでこれを行います。毛の球根を負傷を避けるために深くカット。 </li><li>ウィスカーパッドのウィスカの卵胞を持ち上げて、新鮮なHBSSで新しい皿に入れ。 </li><li>ウィスカの卵胞がきれいになるまで、バッファのホヤとゆるいadipousと皮膚組織をフラッシュします。必要に応じて、ウィスカの卵胞に神経を切断し、こするとHBSSを繰り返しフラッシュすることによって付着組織を除去する。 </li><li>卵胞の隣にある皮膚の部分に保持するためのmicroforcepsを使用して、シャープにタングステン針を使用してSylgardコーティングされたガラスペトリ皿にきれいな毛のfollilceを固定。 </li><li>マイクロブレードでlongitudicallyウィスカの卵胞をカット。この膨らみを傷つけるので、あまり深く切断は避けてください。なくなってまで、HBSSの繰り返しホヤで血を取り外します。血液の外観は、カットが十分な深さだったことを示しています。 longitudialカットが十分に長いではない場合、それが曲がっmicroscissorsと長くなるかもしれない。 </li><li>海綿静脈洞のレベルより上の横方向のカットとリングの洞内のレベルで続いて第二横カットを行い、肌に近い。 </li><li>これで、カプセル内部の出っ張りが表示されます。 </li><li>ピンセットでのコラーゲンのカプセルの端をつかんで、曲がったタングステン針で膨らみをロールアウト。これで、空のカプセルと分離された膨らみが表示されます。 </li><li>プールは室温でHBSSで別々の培養プレートにふくらみを分離。他の組織がプールされたふくらみを汚染されていないことを確認します。 </li></ol>バルジ植の文化<ol><li> 50μlのコラーゲンと隣同士に10μlの滅菌六パーセントのNaClを配置することによって、コラーゲンでコーティング35mmの培養プレートを。ダブル曲がったPasteyrのピペットでよく混和して、培養プレートの端に向かって押し込みます。クリーンデシケーター内で一晩インキュベートするが、乾燥させてください。使用前に、生理食塩水でプレートをすすぎます。 </li><li>プレインキュベーションコラーゲンコート培養培地で約3時間とすすぎ培養プレート。培地は85％のα-改変MEM、10％ウシ胎児血清、5％の11日目ニワトリ胚抽出物で構成されています。 </li><li>再インキュベーション後、プレートから培地を除去し、できるだけ少ない培地でいくつかのふくらみを追加。過剰培地を削除します。 </li><li> 10％酸素、5％CO 2の加湿雰囲気で細胞インキュベーターで、1時間インキュベートする、ではなく、より長い。 </li><li> 1時間後、静かに培養液の1.5 mlを加える。バルジの外植片は、コラーゲン基質に従ってください。毎日培養液の50％を交換してください。 </li><li> 3内に - 4日間、高度回遊性細胞は、バルジの外植片から移住予定。それらの星状の形態、運動性、および細胞間接触の支配的な欠如を注意してください。今後数日にわたって、より多くの細胞が移住し、細胞が急速に増殖するでしょう移住予定。 </li><li>シャープタングステン針とEPI - NCSCの移民の発症後3日間 - 膨らみ2を取り外します。バルジが長く残っている場合、それらは平坦化し、それが不可能な純粋なEPI - NCSCの文化を得るためにする傾向がある。 </li><li> 重要 ：EPI - NCSCより数日後、時々明らかになる、と板状形態を持つ希少な細胞では、EPI - NCSC しない場合に少ない運動ですが、推定上の表皮幹細胞/前駆細胞。 EPI - NCSCと推定表皮幹細胞/前駆細胞を含むこれらの細胞で構成される文化、または混合培養では、破棄する必要があります。 </li><li>ヒント：彼らが推定されるオートクリン/パラクリン増殖因子のシグナル伝達のために、高い細胞密度で急速に差別化する傾向があるので、長すぎる一次外植培地中でのために細胞を保持しない。 </li></ol>

<ol><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+hair+follicle+-+cradle+for+pluripotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells.</a> Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+grafts+in+the+lesioned+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Pub%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord.</a> Pub. 32, 67-81 (2006).</li>
<li>Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature.</a> Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).</li>
</ol>

それらの回遊能力のおかげで、EPI - NCSCは、in vitroで拡張できる幹細胞の高度に純粋な人口として単離することができる。大人の場所にある胚の残党として、EPI - NCSCは、将来の細胞置換療法、生物医学工学および/または再生医療のための潜在的に魅力的な候補です。我々は、彼らが望ましい形質を示す脊髄損傷のマウスモデルでEPI - NCSCをテストしている。我々が期待どおりに、ことを示したLongSAGE（www.ncbi.nlm.nih.gov /ジオ、シリーズ番号GSE4680）、胚の神経堤細胞とEPI - NCSCの共有による遺伝子発現プロファイリング近隣のものとは異なる類似の遺伝子発現パターンを介して表皮幹細胞と他の皮膚の常駐幹細胞/前駆細胞。

マウス表皮神経堤幹細胞（epi - ncsc）文化

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI - NCSCは大人の場所、毛包のバルジの胚神経堤の名残です。彼らは神経細胞、神経支持細胞、平滑筋細胞、骨/軟骨細胞とメラノサイトを含む分化した細胞型の広い配列を生成するために生理学的性質を持つ多能性幹細胞である。 EPI - NCSCは、有毛皮膚に容易にアクセス可能であり、幹細胞の純度の高い人口として単離することができる。このビデオでは、ウィスカの卵胞からマウスEPI - NCSC培養を調製するための詳細なプロトコルを提供します。成体マウスのウィスカーパッドが削除され、ウィスカの卵胞は、解剖される。卵胞は、バルジ領域の上下に縦方向にし、続いて横方向にカットされています。膨らみは、コラーゲンのカプセルから削除され、培養プレートに配置されます。 EPI - NCSCは3〜4日後にバルジの外植片からの移住を開始します。

ここでは、マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）を分離する手法を示す。テクニックは、膨らみを分離し、組織培養にそれをplaceing、ミクロ解剖ウィスカの卵胞を伴います。 4日間 - EPI - NCSCは、3つの内の基層の上に膨らみの外植片からの移住を開始します。

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSCは、成体の毛包バルジという部位に存在する胚性神経堤の残存細胞である。これらは、...を持つ多能性幹細胞である。

こんにちは。ニューカッスル大学の人類遺伝学研究所および北東イングランド幹細胞研究所のMaya Sibu Bloomです。そして、こちらはウィスコンシン医科大学から参加しています。本日は、マウスの卵巣濾胞から外植片（エクスプラント）を調製する手順をご紹介します。B Explanは、表皮神経堤幹細胞培養を調製するための開始組織です。この手順では、ウィスカーパッド（ひげパッド）を解剖して毛包を微小解剖し、その後BULを単離して培養プレートに配置します。それでは、始めていきましょう。本手順は、成マウスのひげ毛包からバルジを切り出すことから始まります。通常、2か月から6か月齢のマウスを使用しますが、より若いマウスの方が幹細胞をより多く得られる傾向があります。動物を安楽死させ、消毒のため、ベタジンと過酸化水素の1:1混合液に約3分間完全に浸します。その後、マウス全体、特に顔面領域に75% ethanolを噴霧し、解剖顕微鏡へと移します。ラミナーフローフード内で、毛球を切り込まないように注意しながらWHIパッドを慎重に解剖し、室温のハンクス平衡塩溶液に入れます。WHI毛包を解剖するには、ピンセットで毛包の隣の皮膚を保持し、直線型のハサミで毛包の周囲を切り出します。深く切り込んでください。毛球を損傷させないよう、ウィスカーパッドからウィスカー毛包を取り出し、新しいプレートに移します。新鮮なHBSSを用いて、同じプレート内で毛包を引き寄せます。鋭利なピンセットと針を用いて、HBSSが入ったシルクガードコートガラスペトリ皿の上に毛包を固定します。緩い脂肪組織と真皮組織をバッファーで洗浄し、触毛毛包がきれいになるまで繰り返します。必要に応じて、触毛毛包に至る神経を切断し、掻き出しとHBSSによる繰り返しの洗浄によって付着組織を除去します。マイクロブレードを用いて、触毛毛包を縦方向に切断します。膨らみを傷つけるため、深く切りすぎないように注意してください。血液が出なくなるまで、HBSSで繰り返し洗浄して除去します。出血が見られれば、切開が十分な深さまで行われた良い指標となります。次に、coness sinusのレベルより上の位置で横断切開を行い、続いて、分離した濾胞片の中の皮膚のごく近いring sinusのレベルで2回目の横断切開を行います。これで、被膜内部に膨らみが確認できるはずです。こちらにあります。ピンセットでカプセルの端をつかみ、膨隆部を取り除きます。これで、空のカプセルと単離された膨隆部プールが確認できます。単離した膨隆部は、室温のHBSSが入った別の培養プレートに回収します。混合した膨起部（bulge）に他の組織が混入していないことを確認してください。この段階で、膨起部植物はbul植物での培養前に培養することが可能です。35 mmの培養プレートに、50 µLのコラーゲンと10 µLの滅菌水を滴下して、コラーゲンでコーティングします。6% salineを隣り合わせに配置します。ダブルベント・ポスターピペットでよく混ぜ、カルチャープレートの端に押し出します。清潔な環境で一晩インキュベートしますが、乾燥させないようにしてください。この目的のため、底部に水を入れたプレートを配置したデシケーターを使用します。翌日、培養日となる。生理食塩水でプレートを洗浄し、コラーゲンコートおよび洗浄済みの培養プレートを、インキュベーター内の培養液中で約3時間プレインキュベートする。培養液は、85% alpha modified MEM、10% fetal bovine serum、および5% 11日齢鶏胚抽出物で構成される。プレインキュベーション後、プレートから培地を除去し、少量の培地と共に数個のBULを添加します。余分な培地を除去してください。10%酸素および5%CO2を含む湿潤環境の細胞インキュベーター内で1時間インキュベートします。1時間後、1.5 mLの培養液をゆっくりと加えます。Medium CHE植物はコラーゲン基質に付着しているはずです。培養液の50%を毎日交換してください。それでは、始めましょう。次に、培養の状態を確認します。3〜4日以内に、遊走性の高い細胞が細胞塊から遊出します。これらの細胞が星状の形態を示し、細胞間接触がほとんど見られないことに注目してください。その後数日間で、さらに多くの細胞が遊出しており、遊出した細胞は急速に増殖します。扁平な形態を持つ重要な希少細胞が、表皮神経堤幹細胞よりも数日遅れて現れることがあります。これらの培養物には、時として幹細胞が見られます。これらの細胞は表皮神経堤幹細胞ではなく、運動性の低い推定上の表皮幹細胞または前駆細胞です。これらの細胞からなる培養物は廃棄してください。ここでは、表皮神経幹細胞を含むバルジ外植え培養の調製方法について説明しました。神経幹細胞は非常に移動性が高いため、3〜4日以内にバルジ外植え組織から離脱します。その後、外植えしたバルジを除去することで、培養プレート内に神経幹細胞の純粋な集団が残ります。この手順を行う際は、汚染を避けるためにマウスを注意深く消毒することを忘れないでください。また、毛包を傷つけないよう、足底の皮膚を深く切開する必要があります。培養に関しては、遊走性の蒸留物、神経堤細胞、および非遊走性の cobblestone 状角質細胞を区別することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

mouse-epidermal-neural-crest-stem-cell-epi-ncsc-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マウス胎児の開発皮質からneuroprecursorsの単離に使用方法を説明します。皮質組織を解剖、子宮から胚を取り外す手順、および分離された大脳皮質を消化することが示されている。...

マウス神経幹細胞の前駆体の文化

in vitroで神経堤幹細胞（NCSC）を育成するために、特殊な培地（NCSCM）が必要です。...

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

この記事では、人間の毛包からの神経堤幹細胞の単離および培養のための堅牢なプロトコルを提案する。...

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に...

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応...

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

このプロトコルの目的は、分子生物学、生化学、蛍光活性化細胞選別、一次インビトロ用途(例えば、クロノジェニック)などの様々な下流アプリケーションのために、成体マウスの後皮から表皮ケラチノサイトを分離することです。ケラチノサイト)。...

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

このプロトコルは、主に細胞移動の研究のために、マウスモデルからの頭蓋神経堤細胞の解剖および培養について説明する。使用されるライブイメージング技術と速度と細胞形状の変化の解析について述べた。...

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

マウス胚性幹細胞から脳神経堤細胞を作製するための再現性のあるサイズのニューロスフェアを生成するための三次元(3D) in vitro...

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

学ぶマウス髭毛囊からの表皮神経堤幹細胞（EPI-NCSC）分離培養法。微小解剖で隆起部を取り出し、組織培養で3〜4日後に細胞遊出を観察する技術を解説。

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

さらに動画を探す