マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

こんにちは。ニューカッスル大学の人類遺伝学研究所および北東イングランド幹細胞研究所のMaya Sibu Bloomです。そして、こちらはウィスコンシン医科大学から参加しています。本日は、マウスの卵巣濾胞から外植片（エクスプラント）を調製する手順をご紹介します。

B Explanは、表皮神経堤幹細胞培養を調製するための開始組織です。この手順では、ウィスカーパッド（ひげパッド）を解剖して毛包を微小解剖し、その後BULを単離して培養プレートに配置します。それでは、始めていきましょう。

本手順は、成マウスのひげ毛包からバルジを切り出すことから始まります。通常、2か月から6か月齢のマウスを使用しますが、より若いマウスの方が幹細胞をより多く得られる傾向があります。動物を安楽死させ、消毒のため、ベタジンと過酸化水素の1:1混合液に約3分間完全に浸します。その後、マウス全体、特に顔面領域に75% ethanolを噴霧し、解剖顕微鏡へと移します。

ラミナーフローフード内で、毛球を切り込まないように注意しながらWHIパッドを慎重に解剖し、室温のハンクス平衡塩溶液に入れます。WHI毛包を解剖するには、ピンセットで毛包の隣の皮膚を保持し、直線型のハサミで毛包の周囲を切り出します。深く切り込んでください。

毛球を損傷させないよう、ウィスカーパッドからウィスカー毛包を取り出し、新しいプレートに移します。新鮮なHBSSを用いて、同じプレート内で毛包を引き寄せます。鋭利なピンセットと針を用いて、HBSSが入ったシルクガードコートガラスペトリ皿の上に毛包を固定します。

緩い脂肪組織と真皮組織をバッファーで洗浄し、触毛毛包がきれいになるまで繰り返します。必要に応じて、触毛毛包に至る神経を切断し、掻き出しとHBSSによる繰り返しの洗浄によって付着組織を除去します。マイクロブレードを用いて、触毛毛包を縦方向に切断します。

膨らみを傷つけるため、深く切りすぎないように注意してください。血液が出なくなるまで、HBSSで繰り返し洗浄して除去します。出血が見られれば、切開が十分な深さまで行われた良い指標となります。

次に、coness sinusのレベルより上の位置で横断切開を行い、続いて、分離した濾胞片の中の皮膚のごく近いring sinusのレベルで2回目の横断切開を行います。これで、被膜内部に膨らみが確認できるはずです。こちらにあります。

ピンセットでカプセルの端をつかみ、膨隆部を取り除きます。これで、空のカプセルと単離された膨隆部プールが確認できます。単離した膨隆部は、室温のHBSSが入った別の培養プレートに回収します。

混合した膨起部（bulge）に他の組織が混入していないことを確認してください。この段階で、膨起部植物はbul植物での培養前に培養することが可能です。35 mmの培養プレートに、50 µLのコラーゲンと10 µLの滅菌水を滴下して、コラーゲンでコーティングします。

6% salineを隣り合わせに配置します。ダブルベント・ポスターピペットでよく混ぜ、カルチャープレートの端に押し出します。清潔な環境で一晩インキュベートしますが、乾燥させないようにしてください。この目的のため、底部に水を入れたプレートを配置したデシケーターを使用します。

翌日、培養日となる。生理食塩水でプレートを洗浄し、コラーゲンコートおよび洗浄済みの培養プレートを、インキュベーター内の培養液中で約3時間プレインキュベートする。培養液は、85% alpha modified MEM、10% fetal bovine serum、および5% 11日齢鶏胚抽出物で構成される。

プレインキュベーション後、プレートから培地を除去し、少量の培地と共に数個のBULを添加します。余分な培地を除去してください。10%酸素および5%CO2を含む湿潤環境の細胞インキュベーター内で1時間インキュベートします。

1時間後、1.5 mLの培養液をゆっくりと加えます。Medium CHE植物はコラーゲン基質に付着しているはずです。培養液の50%を毎日交換してください。それでは、始めましょう。

次に、培養の状態を確認します。3〜4日以内に、遊走性の高い細胞が細胞塊から遊出します。これらの細胞が星状の形態を示し、細胞間接触がほとんど見られないことに注目してください。

その後数日間で、さらに多くの細胞が遊出しており、遊出した細胞は急速に増殖します。扁平な形態を持つ重要な希少細胞が、表皮神経堤幹細胞よりも数日遅れて現れることがあります。これらの培養物には、時として幹細胞が見られます。これらの細胞は表皮神経堤幹細胞ではなく、運動性の低い推定上の表皮幹細胞または前駆細胞です。これらの細胞からなる培養物は廃棄してください。

ここでは、表皮神経幹細胞を含むバルジ外植え培養の調製方法について説明しました。神経幹細胞は非常に移動性が高いため、3〜4日以内にバルジ外植え組織から離脱します。その後、外植えしたバルジを除去することで、培養プレート内に神経幹細胞の純粋な集団が残ります。

この手順を行う際は、汚染を避けるためにマウスを注意深く消毒することを忘れないでください。また、毛包を傷つけないよう、足底の皮膚を深く切開する必要があります。培養に関しては、遊走性の蒸留物、神経堤細胞、および非遊走性の cobblestone 状角質細胞を区別することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。