トレリコンビナーゼの分子進化

私の名前はFrank Alzです。ドレスデンのMax Planck Institute for Macular Cell Biology and Geneticsでグループリーダーを務めています。今回は、分子手術のための部位特異的リコンビナーゼの開発に関する私たちの研究についてお話しします。

基本的には、ゲノムから定義済みの配列を切り出すためのツールとして、より具体的には、ウイルスによって感染したHIV感染細胞を根絶することを目的としています。つまり、感染細胞のゲノムからHIVプロウイルスを切り出すということです。もう一つの概念は、すでに確立されている遺伝学的なツールであるCreリコンビナーゼを適応させ、私たちが事前定義した標的部位を結合・認識し、利用させることです。

そこで私たちは、HIVウイルスのLTRに天然に存在する部位に結合する部位特異的リコンビナーゼを作製できるかという課題に取り組みました。もしそれが可能であれば、ゲノムからプロウイルスを切り出すことができると予測しました。基本的に、ウイルスのライフサイクルには、ウイルスが細胞に組み込まれ、逆転写を通じて2つの末端反復配列に挟まれたDNAテンプレートを形成する段階があります。

これらはロングターミナルリピート、あるいは短くLTRと呼ばれます。そして、これは核内に運ばれ、ホストゲノムのゲノム内にあるほぼランダムな位置に統合されます。これにより、いわゆるプロウイルスと呼ばれる状態になります。これはゲノムに統合されており、2つのロングターミナルリピート、すなわち2つのLTRによって挟まれています。

ここでのコンセプトは、LTRに存在する配列を認識するリコンビナーゼを作製できれば、ホストゲノムからプロウイルスを環状に切り出し、それによって細胞からウイルスを根絶できるはずだということでした。それが概念的なアイデアでした。リコンビナーゼは実際にはDNA結合タンパク質であり、非常に特異的な部位を認識します。

したがって、この酵素はDNA結合ドメインを持っており、DNA内の特定の配列を認識します。そして、この正確な配列が見つかった時にのみ、酵素は活性化されます。他のどの配列に対しても活性は示しません。

分子進化の原理は、基本的には誰にでも知られているはずです。なぜなら、それは育種と全く同じだからです。分子進化の原理とは、まず変異を導入し、次に選択プロセスを経て、特定の特性を選択することにあります。これは植物の育種を行う際と同じです。

特定のサイズや色など、ある一定の特徴を求める場合、次世代の後継個体からその特徴を持つものを常に選び出し、それらを互いに交配させます。これは、私たちが分子に対して行っていることと全く同じです。つまり、基本的にはあらゆる現象と同じですが、それを極小スケールで行っているということになります。

まず、ある活性を持つ酵素（本件ではCREリコンビナーゼ）と、野生型タンパク質を用意します。次に、このリコンビナーゼが結合する部位にわずかな変異を導入しますが、この状態では活性は極めて低いままです。その後、酵素であるリコンビナーゼにランダムな変異を導入し、この変異した部位に結合できるようになった変異体を抽出します。

これを得た後、さまざまな変異体を組み合わせて、最終的に目的とする最終産物を得ることができます。これにより、リコンビナーゼがLTR内で定義した配列を認識するようになります。前述の通り、まずはランダム変異ライブラリから開始します。これは通常、エラー誘発PCRによって行われます。

そこで、例えばTaqポリメラーゼのようにエラー率の高いPCR条件を利用します。これにより、至る所に変異を持つランダムライブラリを生成できます。また、特定の転写産物に多くの変異を導入する細菌の変異原株（ミューテーター株）を使用することも可能です。

そして、これらを出発物質として使用します。我々が使用しているもう一つの技術は、しばらくした後にDNAシャフリングを用いることです。これは基本的に、異なる有益な変異を組み合わせることを可能にする技術です。どの変異が有益であるかを正確に特定することは困難ですが、異なる変異を持つ様々な変異体を得ることができるためです。

このように、ある遺伝子に有益な変異を持つクローンがあり、別の部位に変異を持つ第2のクローンがあるとします。これら2つを統合させるために、まず各断片をランダムに断片化し、次いでPCR反応を用いてこれらの産物を再アセンブリします。すると、ある一定の頻度で、組換えの一部が一方の変異体から、もう一部が他方の変異体から構成される組み合わせが得られます。

そして、ここにあるこの手法にはさらなる効果があり、所望の特性を持つ候補をより迅速に選択できるようになります。例えば、野生型タンパク質が特定の部位に対して全く活性を持たないという定義を設定します。具体的に、HIV LTRから選択した配列を用いてCre recombinaseを試した場合、活性は全く認められません。

CREリコンビナーゼはこの部位を組換えさせることができません。定義上、この配列に結合し、組換えさせることができる酵素が得られたとき、それは新しいリコンビナーゼであると言えます。行うサイクル数は事前に定めていませんでしたが、目的の活性を持つ酵素が得られるまで必要な回数のサイクルを繰り返しました。まず、部位に非常に軽微な変異を導入することから始め、その後、異なる変異を組み合わせていきました。

これは、このプロセスが機能した理由における重要なステップの一つでした。そのため、中間体を経て、次のサイクルに進むのに十分な活性を持つ酵素を見つけるまで、このように多くのサイクルを繰り返す必要がありました。これは、あらゆる育種プロセスと非常に似ています。

目的とする特定の活性や特性を設定し、それに基づいて交配を開始します。そして、望む結果が得られるまで、世代を重ねて交配を繰り返す必要があります。基本的にはそのようなプロセスになります。

また、120回の進化サイクル、正確には128回を行ったところについても述べておく必要があります。これは、ある程度の活性が得られたため、ここで停止できるという中間段階を見つけるためのものです。現在得られている組換え酵素は、野生型のCRE組換え酵素よりもまだ活性が低いため、より活性の高い組換え酵素を得るには、さらに進化サイクルを繰り返す必要があります。

したがって、進化プロセスにおいて、現状が実質的な終着点になることはありません。技術的な制限は見当たりませんが、これをどこまで推し進められるかは不透明です。

したがって、LTR側についてですが、LTR HAで見出される配列は、天然のloxP側、すなわちCreリコンビナーゼが認識する天然の部位と50%の配列類似性を有しています。そこで疑問となるのは、さらにその先まで追求できるかということであり、これについてはまだ分かっていません。しかし、野生型の部位に対して50%の配列類似性しか持たないにもかかわらず機能しているという事実は、さらにこの条件を推し進められる可能性を示唆しています。リコンビナーゼは、前述した通り、本来の認識部位にある場合ほど活性は高くありませんが、ヒト組織培養細胞においても十分に機能します。

したがって、おそらく安定性はクエリリコンビナーゼ（野生型酵素）よりもいくらか低く、将来的にはこれらの特性を向上させるためにより多くの選択とより多くの進化サイクルが必要になると思われます。そこで最初のステップとしては、この特定のリコンビナーゼである3リコンビナーゼの部位を改良して活性を高めること、あるいはLTRにおける優れた標的となり得る他の顕著な部位を見つけ出し、それらに適した非常に優れたリコンビナーゼを見出すことが挙げられます。その後、まず再び組織培養細胞を用いて、そして非常に重要な点として、動物モデルを用いて、このリコンビナーゼをさまざまなアッセイで検証する必要があります。

したがって、このリコンビナーゼが生物体内で望ましくない副作用を引き起こさないかを確認する必要があります。そして、当然ながら非常に困難な側面は、このリコンビナーゼのための優れたデリバリーシステムを開発することであり、これは単純なことではありません。その開発自体が、一つの独立した研究領域となっています。

それは基本的に、私たちが採用しなければならない遺伝子治療のアプローチでした。医学はますます分子レベルへと移行していると思います。そして当然ながら、そのようなスケールで研究を行うためには、適切なツールが必要になります。

そして、ここが進化プロセスの未来であると考えています。つまり、私たちが実際に利用したいと考えているプロセスに作用する、カスタムメイドの酵素を作製する必要があります。リコンビナーゼの場合、これは外科医が手術で切除する必要がある部位を切り出すためのツールに例えられるかもしれません。今、私たちに必要なのは、分子外科医がゲノムから特定のDNA断片を特異的に切除するためのツールなのです。

そして、これを実現するためには、適切なツールが必要です。分子進化が基本的にこの機能を果たすことができます。自然界には、これを可能にする非常に望ましい特性を持つ多くの酵素が存在します。

そして、それらを有用にするためには、私たちのニーズに合わせて調整する必要があります。ここで、分子進化が非常に重要な役割を果たすと考えています。限界がどこにあるのかを現時点で断言するのは困難です。なぜなら、この分野の技術はまだ非常に初期の段階にあるからです。

したがって、どのような制限があるかは時間が経てばわかるでしょう。いくつか制限が出てくることは間違いありませんが、現時点では、制限よりもむしろ機会の方が多いと考えています。