Name: トレリコンビナーゼの分子進化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ、Creリコンビナーゼを出発点とした指向性分子進化により、HIV-1プロウイルスを標的とするTreリコンビナーゼの開発手法。この酵素は感染細胞からウイルスゲノムを切除し、潜伏感染根絶への新たな遺伝子治療戦略を示唆している。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者に開示すべき事項はありません。

トレリコンビナーゼの分子進化

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。 我々は、Cre、loxP部位として知られている34 - bpの二本鎖DNA配列を認識する38 kDaのリコンビナーゼ、作業を開始しています。 Creを効果的にゲノム配列を排除することができますので、調整に統合されたHIV - 1プロウイルスの5&#39; - LTRと3&#39; - LTRの間にシーケンスを削除することができるリコンビナーゼを設定します。最初のステップとして、我々はloxP部位に類似し、組換えの活性について試験したLTRサイト内の配列を同定した。当初のCreと変異誘発CREのライブラリは、HIV - 1プロウイルスの選ばれたloxLTRサイトを再結合に失敗しました。どんな指示分子進化のプロセスの開始が、少なくとも残存活性を必要とするため、オリジナルの非対称loxLTRシーケンスはサブセットに分割し、再結合活性を再び検査した。中間体として機能する、組換え活性は、サブセットで示された。次に、リコンビナーゼのライブラリが何度も繰り返され進化のサイクルによって濃縮した。その後、濃縮されたライブラリがシャッフルし、再結合されました。さまざまな変異の組み合わせは、相乗証明とリコンビナーゼはloxLTR1とloxLTR2を再結合することができたが作成されました。これにより、中間体を介して進化戦略が成功を収めることができるという証拠だ。 126進化のサイクルの合計した後、個々のリコンビナーゼは、機能的及び構造的に分析した。最もアクティブなリコンビナーゼ - トレは - のCreと比較して19個のアミノ酸の変化がありました。トレリコンビナーゼは、消費税ゲノムHIV - 1感染HeLa細胞（参照してください&quot;進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し&quot;、Hauber J.、実験的ウイルス学と免疫学のためのハインリヒ- Pette研究所、からHIV - 1プロウイルスをすることができたハンブルク、ドイツ）。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化は、&quot;分子手術&quot;と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化、分子手術と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。

ここでは、指向性分子進化によるTreリコンビナーゼの作製について報告する。Treリコンビナーゼは、...内の定義済みの標的配列を認識する。

私の名前はFrank Alzです。ドレスデンのMax Planck Institute for Macular Cell Biology and Geneticsでグループリーダーを務めています。今回は、分子手術のための部位特異的リコンビナーゼの開発に関する私たちの研究についてお話しします。基本的には、ゲノムから定義済みの配列を切り出すためのツールとして、より具体的には、ウイルスによって感染したHIV感染細胞を根絶することを目的としています。つまり、感染細胞のゲノムからHIVプロウイルスを切り出すということです。もう一つの概念は、すでに確立されている遺伝学的なツールであるCreリコンビナーゼを適応させ、私たちが事前定義した標的部位を結合・認識し、利用させることです。そこで私たちは、HIVウイルスのLTRに天然に存在する部位に結合する部位特異的リコンビナーゼを作製できるかという課題に取り組みました。もしそれが可能であれば、ゲノムからプロウイルスを切り出すことができると予測しました。基本的に、ウイルスのライフサイクルには、ウイルスが細胞に組み込まれ、逆転写を通じて2つの末端反復配列に挟まれたDNAテンプレートを形成する段階があります。これらはロングターミナルリピート、あるいは短くLTRと呼ばれます。そして、これは核内に運ばれ、ホストゲノムのゲノム内にあるほぼランダムな位置に統合されます。これにより、いわゆるプロウイルスと呼ばれる状態になります。これはゲノムに統合されており、2つのロングターミナルリピート、すなわち2つのLTRによって挟まれています。ここでのコンセプトは、LTRに存在する配列を認識するリコンビナーゼを作製できれば、ホストゲノムからプロウイルスを環状に切り出し、それによって細胞からウイルスを根絶できるはずだということでした。それが概念的なアイデアでした。リコンビナーゼは実際にはDNA結合タンパク質であり、非常に特異的な部位を認識します。したがって、この酵素はDNA結合ドメインを持っており、DNA内の特定の配列を認識します。そして、この正確な配列が見つかった時にのみ、酵素は活性化されます。他のどの配列に対しても活性は示しません。分子進化の原理は、基本的には誰にでも知られているはずです。なぜなら、それは育種と全く同じだからです。分子進化の原理とは、まず変異を導入し、次に選択プロセスを経て、特定の特性を選択することにあります。これは植物の育種を行う際と同じです。特定のサイズや色など、ある一定の特徴を求める場合、次世代の後継個体からその特徴を持つものを常に選び出し、それらを互いに交配させます。これは、私たちが分子に対して行っていることと全く同じです。つまり、基本的にはあらゆる現象と同じですが、それを極小スケールで行っているということになります。まず、ある活性を持つ酵素（本件ではCREリコンビナーゼ）と、野生型タンパク質を用意します。次に、このリコンビナーゼが結合する部位にわずかな変異を導入しますが、この状態では活性は極めて低いままです。その後、酵素であるリコンビナーゼにランダムな変異を導入し、この変異した部位に結合できるようになった変異体を抽出します。これを得た後、さまざまな変異体を組み合わせて、最終的に目的とする最終産物を得ることができます。これにより、リコンビナーゼがLTR内で定義した配列を認識するようになります。前述の通り、まずはランダム変異ライブラリから開始します。これは通常、エラー誘発PCRによって行われます。そこで、例えばTaqポリメラーゼのようにエラー率の高いPCR条件を利用します。これにより、至る所に変異を持つランダムライブラリを生成できます。また、特定の転写産物に多くの変異を導入する細菌の変異原株（ミューテーター株）を使用することも可能です。そして、これらを出発物質として使用します。我々が使用しているもう一つの技術は、しばらくした後にDNAシャフリングを用いることです。これは基本的に、異なる有益な変異を組み合わせることを可能にする技術です。どの変異が有益であるかを正確に特定することは困難ですが、異なる変異を持つ様々な変異体を得ることができるためです。このように、ある遺伝子に有益な変異を持つクローンがあり、別の部位に変異を持つ第2のクローンがあるとします。これら2つを統合させるために、まず各断片をランダムに断片化し、次いでPCR反応を用いてこれらの産物を再アセンブリします。すると、ある一定の頻度で、組換えの一部が一方の変異体から、もう一部が他方の変異体から構成される組み合わせが得られます。そして、ここにあるこの手法にはさらなる効果があり、所望の特性を持つ候補をより迅速に選択できるようになります。例えば、野生型タンパク質が特定の部位に対して全く活性を持たないという定義を設定します。具体的に、HIV LTRから選択した配列を用いてCre recombinaseを試した場合、活性は全く認められません。CREリコンビナーゼはこの部位を組換えさせることができません。定義上、この配列に結合し、組換えさせることができる酵素が得られたとき、それは新しいリコンビナーゼであると言えます。行うサイクル数は事前に定めていませんでしたが、目的の活性を持つ酵素が得られるまで必要な回数のサイクルを繰り返しました。まず、部位に非常に軽微な変異を導入することから始め、その後、異なる変異を組み合わせていきました。これは、このプロセスが機能した理由における重要なステップの一つでした。そのため、中間体を経て、次のサイクルに進むのに十分な活性を持つ酵素を見つけるまで、このように多くのサイクルを繰り返す必要がありました。これは、あらゆる育種プロセスと非常に似ています。目的とする特定の活性や特性を設定し、それに基づいて交配を開始します。そして、望む結果が得られるまで、世代を重ねて交配を繰り返す必要があります。基本的にはそのようなプロセスになります。また、120回の進化サイクル、正確には128回を行ったところについても述べておく必要があります。これは、ある程度の活性が得られたため、ここで停止できるという中間段階を見つけるためのものです。現在得られている組換え酵素は、野生型のCRE組換え酵素よりもまだ活性が低いため、より活性の高い組換え酵素を得るには、さらに進化サイクルを繰り返す必要があります。したがって、進化プロセスにおいて、現状が実質的な終着点になることはありません。技術的な制限は見当たりませんが、これをどこまで推し進められるかは不透明です。したがって、LTR側についてですが、LTR HAで見出される配列は、天然のloxP側、すなわちCreリコンビナーゼが認識する天然の部位と50%の配列類似性を有しています。そこで疑問となるのは、さらにその先まで追求できるかということであり、これについてはまだ分かっていません。しかし、野生型の部位に対して50%の配列類似性しか持たないにもかかわらず機能しているという事実は、さらにこの条件を推し進められる可能性を示唆しています。リコンビナーゼは、前述した通り、本来の認識部位にある場合ほど活性は高くありませんが、ヒト組織培養細胞においても十分に機能します。したがって、おそらく安定性はクエリリコンビナーゼ（野生型酵素）よりもいくらか低く、将来的にはこれらの特性を向上させるためにより多くの選択とより多くの進化サイクルが必要になると思われます。そこで最初のステップとしては、この特定のリコンビナーゼである3リコンビナーゼの部位を改良して活性を高めること、あるいはLTRにおける優れた標的となり得る他の顕著な部位を見つけ出し、それらに適した非常に優れたリコンビナーゼを見出すことが挙げられます。その後、まず再び組織培養細胞を用いて、そして非常に重要な点として、動物モデルを用いて、このリコンビナーゼをさまざまなアッセイで検証する必要があります。したがって、このリコンビナーゼが生物体内で望ましくない副作用を引き起こさないかを確認する必要があります。そして、当然ながら非常に困難な側面は、このリコンビナーゼのための優れたデリバリーシステムを開発することであり、これは単純なことではありません。その開発自体が、一つの独立した研究領域となっています。それは基本的に、私たちが採用しなければならない遺伝子治療のアプローチでした。医学はますます分子レベルへと移行していると思います。そして当然ながら、そのようなスケールで研究を行うためには、適切なツールが必要になります。そして、ここが進化プロセスの未来であると考えています。つまり、私たちが実際に利用したいと考えているプロセスに作用する、カスタムメイドの酵素を作製する必要があります。リコンビナーゼの場合、これは外科医が手術で切除する必要がある部位を切り出すためのツールに例えられるかもしれません。今、私たちに必要なのは、分子外科医がゲノムから特定のDNA断片を特異的に切除するためのツールなのです。そして、これを実現するためには、適切なツールが必要です。分子進化が基本的にこの機能を果たすことができます。自然界には、これを可能にする非常に望ましい特性を持つ多くの酵素が存在します。そして、それらを有用にするためには、私たちのニーズに合わせて調整する必要があります。ここで、分子進化が非常に重要な役割を果たすと考えています。限界がどこにあるのかを現時点で断言するのは困難です。なぜなら、この分野の技術はまだ非常に初期の段階にあるからです。したがって、どのような制限があるかは時間が経てばわかるでしょう。いくつか制限が出てくることは間違いありませんが、現時点では、制限よりもむしろ機会の方が多いと考えています。

molecular-evolution-of-the-tre-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

現在のHIV - 1の戦略は、ウイルスのライフサイクルを抑制する働きが効果的に感染を根絶することはありません。ここで、我々は人工リコンビナーゼは、感染細胞のゲノムから効率的に切り出す統合されたHIV -...

インタビュー：進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し

相同組換え技術は大きく前進...

における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変<em&gt;ショウジョウバエ</em

酵母ミトコンドリア核様体タンパク質、Mgm101は、大きなオリゴマーの環を形成するRAD52型組換えタンパク質である。プロトコルは、陽イオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと連結マルトース結合タンパク質（MBP）タギング方式を使用して可溶性組換えMgm101を調製するために記載されている。...

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

ここでは、T細胞受容体切除サークル(TREC)とK-欠失組換え切除サークル(KRECs)の同時定量化の方法について説明します。TREC/KRECアッセイは、胸腺および骨髄出力のマーカーとして使用できます。...

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

新しい配列特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは、部分的に縮退配列を認識する酵素から開発することができる。ここでは、NlaIV酵素の配列特異性を変更するために使用した詳細なプロトコルを提供します。プロトコルの主な成分は、転写/翻訳反応のインビトロ区画化と新しい配列特異性を有するバリアントの選択である。...

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術とCre / LOX系の出現は、分子生物学における数々の進歩につながっている、そしてトランスジェニック動物での遺伝子機能を評価するための貴重なツールとしての地位を証明しています。このインタビューでは、環化リコンビナーゼ（Cre）を、どのようにこの酵素の使用は、戦略より伝統的なノックアウト比べて大きな利点を持っている条件付き変異誘発、の開発につながっていることにより部位特異的組換えのメカニズムについて説明します。...

部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術の原理

私たちは、捕食リスクが高まりストレスの要求を満たすために食生活の変化を誘導することによって、草食動物の餌の化学的性質を変えることができるかを評価するための方法を提示し、どのようにこれらのストレス草食動物から死体の分解は土壌微生物によって後続の植物リターの分解が遅くなります。...

捕食リスク、草食動物生理的ストレスと植物リターの微生物分解を結ぶ

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA...

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

ワムシは、生態毒性学および老化研究のモデルとして使用される微細な動物プランクトンです。ここでは、Brachionusワムシの生存時間を強力かつ再現性よく測定するためのプロトコルを提供します。母性の状態は子孫の生活史に影響を与えるため、数世代にわたる培養条件の同期は特に重要です。...

生存時間の測定で<em&gt; Brachionus</em&gt;ワムシ：母性条件の同期

学ぶ、Creリコンビナーゼを出発点とした指向性分子進化により、HIV-1プロウイルスを標的とするTreリコンビナーゼの開発手法。この酵素は感染細胞からウイルスゲノムを切除し、潜伏感染根絶への新たな遺伝子治療戦略を示唆している。

トレリコンビナーゼの分子進化

さらに動画を探す