Name: インタビュー：進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ HIV-1プロウイルスDNAの切り出し法。進化リコンビナーゼを用いて感染細胞から統合ウイルスDNAを除去する革新的な遺伝子治療アプローチを解説し、HIV根絶への可能性を示す。

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と題する関連動画を表示してください<a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=718" target="_blank">部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術の原理</a>と<a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=791" target="_blank">トレリコンビナーゼの分子進化</a>部位特異的組換えとエンジニアリングリコンビナーゼ酵素の部位特異性の詳細については、を。

著者に開示すべき事項はありません。

インタビュー：進化リコンビナーゼを用いたhiv - 1プロウイルスdnaの切り出し

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV - 1は感染細胞の宿主染色体に統合し、長い末端反復配列に挟まれたプロウイルスとして持続します。現在の治療戦略は、主に感染症を根絶することなく、ウイルスの酵素やウイルスの細胞融合、抑制するウイルスのライフサイクルを対象としています。統合されたプロウイルスは、これらの手法によって対象とされていないため、HIV - 1の新たな耐性菌が出現する可能性があります。ここで、我々は人工リコンビナーゼトレは（トレリコンビナーゼ、バックホルツ、F.、細胞生物学および遺伝学のマックスプランク研究所、ドレスデンの分子進化を参照）効率的に感染細胞のゲノムから統合されたHIV - 1プロウイルスDNAを消費税と報告している。我々は、トレリコンビナーゼは、HIV - 1感染ヒト細胞のゲノムから切り出すプロウイルスをできるかどうかを調べるためにloxLTR含むウイルス疑似型と感染したHeLa細胞を作り出した。ウイルス粒子放出細胞株をクローニングし、発現プラスミドトレでまたはペアレンタルコントロールのベクターでトランスフェクトした。リコンビナーゼ活性とウイルス産生をモニターした。すべてのアッセイは、目に見える細胞傷害作用することなく感染細胞からプロウイルスの効率的な削除を示した。これらの結果は、それが具体的にHIV - 1 LTRをターゲットにリコンビナーゼを進化させることが可能であり、このリコンビナーゼは、HIV - 1感染ヒト細胞のゲノムからHIV - 1プロウイルスを切り出すことが可能であることを原理の証明として役立つ。 設計リコンビナーゼは、治療の分野に入ることができる前に、しかし、重大な障害が克服される必要があります。最も重要な問題の中で、我々が直面している、標的細胞への効率的かつ安全に配信して副作用のないことです。

現在のHIV - 1の戦略は、ウイルスのライフサイクルを抑制する働きが効果的に感染を根絶することはありません。ここで、我々は人工リコンビナーゼは、感染細胞のゲノムから効率的に切り出す統合されたHIV - 1プロウイルスDNAができることを示している。

インタビュー：進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し

HIV-1は感染細胞の宿主染色体に組み込まれ、末端反復配列（LTR）に挟まれたプロウイルスとして持続的に存在します。現在の治療戦略は…

私はJohE Hvarで、ドイツのハンブルクにあるHE Pet Instituteの細胞生物学・生物学部門の責任者を務めています。HE PET Instituteは、ヒトのpe、病原性ウイルス、およびそれらに関連する問題に特化した基礎研究機関です。私たちの部門では、主にHIV遺伝子発現の調節、および特に宿主細胞の構成成分とHIVとの細胞内相互作用についての研究に関心を持っています。これらのデータに基づき、我々はHIV疾患に対する新しい実験的治療法の開発にも取り組んでいます。HIVにおける問題点は、HIVがレトロウイルスまたはレンチウイルスであり、あらゆるレトロウイルスと同様に、宿主細胞への感染時にウイルスゲノムが宿主細胞のゲノムに組み込まれることです。そのため、一度組み込まれたプロウイルスを完全に排除することは、現在のところ不可能です。つまり、治療の観点から言えば、一生涯にわたる治療を必要とする慢性疾患について話しており、基本的には薬の副作用や耐性の出現など、生涯治療に伴うあらゆる問題がつきまといます。さて、基礎研究の分野では長年、例えば酵母や細菌などで自然に起こる組換えに関与する、いわゆるリコンビナーゼ（組換え酵素）の存在が知られています。これらのリコンビナーゼは特定のDNA配列を認識し、遺伝子のシャッフルやゲノムの再編成などを行います。特に、Creリコンビナーゼと呼ばれる組換え酵素は、基礎研究やin situでの研究に使用されています。Creは基本的にその特異的な配列を認識します。2つの認識部位の間に配列が存在する場合、Creは基本的にその介在配列を切り出すことができます。10年から15年前からある考え方は、医学的にウイルスを根絶することであり、その一方で、例えばCreのようなリコンビナーゼを用いてプロウイルスDNAを切り出すことです。これは理論上可能であるはずです。なぜなら、感染時にHIVは自身のRNAゲノムをDNAへと逆転写し、この逆転写プロセスによってロングターミナルリピート（LTR）と呼ばれる配列が生成され、これが統合されたプロウイルスDNAの5'末端（開始点）と3'末端（終了点）を基本的にマークしているからです。したがって、理論的に、LTR内の特定の配列を特異的に認識するリコンビナーゼを開発できれば、そのリコンビナーゼが統合されたプロウイルスDNAの5'末端と3'末端を攻撃してDNAを切り出し、感染細胞からウイルスを基本的に根絶できることになります。さて、HIVにおける問題は、おそらく単一の個人、つまり単一の患者内であっても異なる分離株が存在することですが、これまでに分かっている限り、特にこの配列はウイルスゲノムの開始点と終了点に存在しています。つまり、言い換えれば、LTRは例えばHIV遺伝子よりも保存性が高いということです。したがって、すべてのHIV分離株の広範な多様性を基本的に認識できる、少数のリコンビナーゼがあれば十分である可能性が高いと考えています。もし不十分な場合は、分子進化によって新しいものを生成する必要があり、これは将来的には半自動化できると考えられます。そして、このプロセスは研究室で実施するよりもはるかに迅速になります。私たちの同僚であるMax Planck研究所のDr. Frankが、この計画の最後に加わりました。彼は基本的に、リコンビナーゼとそれに関連するあらゆる事項のエキスパートです。基本的に彼が用いたのは、分子進化法と呼ばれる手法です。この手法は PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）技術に基づいています。彼は天然に存在するリコンビナーゼである Dre recombinase の遺伝子を用い、ランダムに突然変異が導入される条件下で PCR または複数の PCR 反応を行います。ここでのポイントは、HIV特異的な配列を認識するという新しい能力や活性を獲得したリコンビナーゼの新バージョンを選択することです。そして、彼はこれを繰り返しのサイクルで行っています。この種の分子進化手法を用いるために、彼は約120回、あるいは120回以上のサイクルを繰り返しました。最終的に、現在LTR特異的組換えと呼ばれているこの特定の、HIV配列を特異的に認識する新しい組換え酵素が考案されました。ここでの初期研究、すなわち組換え酵素を用いた実験は、ハンブルクのHE PET研究所で実施されました。具体的に行ったことは、臨床分離株に近いHIV-1に感染させたヒト細胞培養に、遺伝子ベクターを用いてこの組換え酵素を導入することでした。そして、6〜8週間にわたる時間をかけて、私たちはそれを実証することができました。現在、リコンビナント（組換え体）は定量的に見て非常に有望であり、HIVプロファイルDAを統合した結果、基本的には培養物全体からHIVが除去され、治療されました。もちろん、この技術には依然として数多くの課題が存在します。まず、リコンビナーゼの発現が毒性のある副作用を引き起こしていないことを確認する必要があります。自然界に存在するCreのような組換えに関しては、いわゆるトランスジェニック動物が存在するため、このような副作用は想定していません。これらの動物はCre組換えを発現していますが、いくつかの問題はあるものの、それほど重大なものではありません。現時点ではそう言えるかもしれません。したがって、毒性副作用がないという希望はありますが、実際に実験を行ってみなければ分からないものです。また、すべての臨床分離株を認識できるわけではないため、患者内の優勢なHIV分離株を排除できない可能性があるという問題もあります。しかし、時間をかけてマイナーな分離株からさらにマイナーなものを選択していくことになります。これについてはまだ分かっていないため、これらの実験を行う必要があります。さらに、遺伝子導入やベクター技術において大きな課題があります。遺伝子またはリコンビナーゼ遺伝子を導入するために、いわゆるレンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターを使用する必要があります。そこで、副作用はあるのでしょうか。これらのベクターは毒性影響を引き起こすのでしょうか。以上の質問がすべてです。また、コームの活性を向上させたいと考えています。組換えは現在、数週間にわたって観察しているよりも速く作用していると思われます。したがって、これらは今後数年かけて解決すべき未解決の課題です。そして、リコンビナーゼは経口投与ができないため、これが現在の確実な問題となっています。つまり、リコンビナーゼの錠剤を飲んで、それでウイルスを除去するという方法は存在しないということです。したがって、将来的な治療法について考察すると、遺伝子治療アプローチを検討する必要があります。例えば、HIV感染患者の血液から、いわゆる造血幹細胞またはCD 34陽性細胞を単離し、研究室においてこれらの患者細胞にcombs遺伝子を導入するという手法が考えられます。最後に、遺伝子改変した患者自身の細胞を、再びその患者の背中に再注入（再輸注）します。これにより、時間の経過とともに、患者の免疫系または造血系が、少なくとも部分的に再構築されることが期待されます。これらの細胞は、HIVに感染しても、リコンビナーゼを発現しているため、ウイルスを排除することができます。その結果、患者のウイルス量は低下し、生活の質（QOL）が確実に向上すると考えられます。また、これらの患者において免疫系が少なくとも部分的に再構築されることが期待されます。これにより、完全に機能を取り戻した免疫細胞が、患者内に残存する潜伏感染細胞を攻撃できることが望まれます。患者からHIVを完全に、そして徹底的に根絶できるかどうかについては、現時点では断定できません。

interview-hiv-1-proviral-dna-excision-using-an-evolved-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化、分子手術と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。...

トレリコンビナーゼの分子進化

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

ほぼ同質遺伝子のウイルス間の成長競争は、相対的な複製適応度を決定するための高感度な測定を提供します。ここで説明するプロトコルには、組換えHIV-1クローンの構築、ウイルスの増殖と増殖の競合、および高感度で一貫性のある結果を得るために最適化された分析方法が含まれます。...

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。...

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

潜在性の決定の増幅とフルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスに効率的かつ高スループット方法を提供でき、フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転)レプリケーション能力。反転は、潜在的な HIV 1...

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

プロウイルス選択したゲノム サイト統合を要約 HIV-1 感染の新しい体外モデルの生成のゲノム工学ワークフローを提案します。記者の HIV 由来のターゲットは、CRISPR Cas9...

選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学

初期 3' 末端の公平な測定だけでなく、単一座礁させた DNA の分子の変異プロファイルを提供するディープ シーケンス アプローチをご紹介します。メイン アプリケーションは、初期のレトロ ウイルス相補的 Dna (Cdna)、レトロ...

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

HIV の効率的な再活性化の機能評価および潜在的な proviruses のクリアランスのための高いスループット プロトコル説明および HIV 転写の介入の影響をテストおよび選択的スプライシングによって適用しました。LTR...

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10...

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

学ぶ HIV-1プロウイルスDNAの切り出し法。進化リコンビナーゼを用いて感染細胞から統合ウイルスDNAを除去する革新的な遺伝子治療アプローチを解説し、HIV根絶への可能性を示す。

インタビュー：進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し

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